Fenotipificación de reacciones

En los estudios de fenotipificación de reacciones se evalúa el impacto de inhibidores específicos de isoformas de enzimas sobre la desaparición de un artículo de prueba matriz incubado en microsomas hepáticos humanos agrupados. La incubación con isoformas de enzimas recombinantes metabolizadoras de fármacos individuales confirma las actividades de las enzimas. La evaluación de las enzimas responsables de metabolizar un artículo de prueba puede destacar posibles inconvenientes como que las vías metabólicas sean catalizadas por una sola enzima o por enzimas expresadas polimorfológicamente.

Consideraciones reglamentarias para estudios de fenotipificación de reacciones

La investigación de enzimas CYP (CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6 y CYP3A) se recomienda como investigación inicial para comprender mejor las secuencias de depuración del fármaco según las pautas de interacción farmacológica (DDI). Si estas enzimas CYP principales no están involucradas en el metabolismo del fármaco, entonces se evaluarían otras encimas en la fase I y fase II, entre ellas:

  • Enzimas CYP (CYP2A6, CYP2J2, CYP4F2 y CYP2E1)
  • Enzimas no CYP como aldehído oxidasa (AO), carboxilesterasa (CES), monoamino oxidasa (MAO), flavin monooxigenasa (FMO), xantina oxidasa (XO) y alcohol/aldehído deshidrogenasa (ADH/ALDH)
  • Enzimas conjugativas como UDP glucoronil transferasas (UGT) y sulfotransferasas (SULT)

La fenotipificación de reacciones provee información sobre la fracción metabolizada de los artículos de prueba y se puede usar para evaluar el potencial de DDI, obtener datos para diseñar un estudio clínico, predecir la variabilidad individual en farmacocinética y evaluar el impacto del polimorfismo genético.


Métodos

  • Sistema de prueba: microsomas hepáticos humanos agrupados y enzimas humanas recombinantes expresadas individualmente con los cofactores necesarios
  • Isoformas CYP: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 y CYP3A4. (También hay otras enzimas CYP, UGT y enzimas metabolizadoras de fármacos disponibles).
  • Inhibidores químicosespecíficos de isoformas y enzimas recombinantes para confirmación.

El artículo de prueba se preincuba por al menos 5 minutos con microsomas en buffer de fosfatos. El metabolismo del artículo de prueba se inicia con la adición de NADPH u otro cofactor adecuado. Las incubaciones se terminan con la adición de un solvente orgánico y luego se analizan las muestras para detectar el artículo de prueba y/o sus metabolitos usando cromatografía de líquidos-espectometría de masas (LC-MS).

Fase I: optimización de condiciones de incubación in vitro

El artículo de prueba se incuba en triplicados con una variedad de concentraciones de microsomas (generalmente 0,1 - 1 mg deproteína/mL) por cuatro puntos temporales de hasta 60 minutos en presencia de NADPH u otro cofactor adecuado.

Se realizan incubaciones de control en ausencia de un cofactor. Las condiciones de incubación de concentración de microsomas y punto temporal que producen una índice lineal de desaparición del artículo de prueba se usan para definir los experimentos de seguimiento.

Fase II: análisis cinético del metabolismo del artículo de prueba

Los índices de qué tan rápido desaparece el artículo de prueba se monitorean en las muestras de incubación con al menos ocho concentraciones del artículo de prueba en triplicados bajo condiciones optimizadas. Los datos se analizan usando la curva de Michaelis-Menten y se determinan los parámetros cinéticos Km y Vmax para el artículo de prueba.

Fase III: análisis de inhibición usando inhibidores químicos específicos de CYP

El artículo de prueba se incuba en triplicados a una concentración de <Km con microsomas hepáticos humanos agrupados en la ausencia o presencia de inhibidores químicos selectivos de enzimas. Se realizan incubaciones de control en la ausencia del inhibidor usando solo solvente.

Fase IV: metabolismo usando CYP humanas recombinantes

El artículo de prueba se incuba en triplicados a una concentración de <Km con una variedad de CYP y UGT humanas recombinantes, y otras DME (ver arriba). Se mide la concentración relativa del artículo de prueba a los 0 y 60 minutos. 

Productos finales

Estos ensayos identificarán las enzimas responsables de y el alcance de metabolismo del artículo de prueba in vitro. Se determina la cinética de la desaparición del artículo de prueba y/o formación de metabolitos.  La evaluación de metabolismo in vitro identifica a las enzimas principales involucradas y detecta posibles problemas en el mecanismo de eliminación in vivo antes de hacer pruebas en humanos.