- Sistema de prueba: plasma agrupado de cada especie o soluciones de proteína de plasma específicas (por ej., albúmina en suero humana, glicoproteína de ácido α1, gammaglobulina)
- Se seleccionan las concentraciones para abarcar exposiciones clínicas conocidas (0,1 - 10X Cmax), a menos que haya una limitación por la solubilidad.
Diálisis de equilibrio
El diálisis de equilibrio se realiza usando un aparato de diálisis de alto volumen (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT). Se agrega una matriz fortificada (ya sea plasma o proteína de plasma aislada) a la cámara del donante y se agrega solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) a la cámara del receptor de cada pocillo. Las placas luego se sellan con una membrama permeable de gases y se incuba a 37 °C en 5% CO2 por el tiempo designado (ver abajo). Después de la incubación se analizan las muestras de cada cámara usando cromatografía de líquidos-espectometría de masas (LC-MS).
- Estabilidad en la matriz: el artículo de prueba se incuba en plasma y en DPBS a una sola concentración de hasta cinco puntos temporales.
- Tiempo al equilibrio: el artículo de prueba se agrega al plasma a una sola concentración y se dializa contra el DPBS para hasta cinco puntos temporales.
- Dependencia de concentración de unión de proteínas: el artículo de prueba se agrega al plasma a tres concentraciones y se dializa contra el DPBS por el tiempo requerido para el equilibrio.
- Un control positivo como warfarin se prueba en diálisis de equilibrio paralela por ≥5 horas.
Ultrafiltración
El plasma fortificado se agregará a la porción de la reserva de plasma de un dispositivo de ultrafiltración con un corte de peso molecular de 30.000 Da. Las muestras se centrifugarán a 37 °C y 2.000 × g por 15 minutos (u otras condiciones apropiadas). Después de la centrifugación, el ultrafiltrado se analizará por LC-MS para detectar el artículo de prueba y comparar el contenido con las concentraciones iniciales. Todas las determinaciones de unión de proteínas se harán por triplicado.
- Unión no específica: el artículo de prueba se agrega al ultrafiltrado de plasma (PUF) de control a dos concentraciones y se centrifuga según el procedimiento de ultrafiltración. Se analizará el dialisato para determinar la recuperación del artículo de prueba y la posible unión no específica en la ausencia de plasma.
- Dependencia de concentración de unión de proteínas: el artículo de prueba se agrega al plasma a cinco concentraciones y se centrifuga según el procedimiento de ultrafiltración. El ultrafiltrado se analizará para detectar el artículo de prueba.
Ultracentrifugación
El plasma fortificado se agregará a los tubos de la ultracentrifugadora y se centrifugarán a 37 ºC a 223.000 × g por 4 horas (u otras condiciones apropiadas) para alcanzar la separación del ultracentrifugado de plasma de la proteína de plasma. Tras la centrifugación, el ultracentrifugado se analizará por LC-MS y se comparará con las concentraciones iniciales.
- Unión no específica: el artículo de prueba se agrega al plasma de control y ultrafiltrado de plasma (PUF) a dos concentraciones y se incuba en los tubos de la ultracentrifugadora por 4 horas. Se analizará la matriz para determinar la recuperación del artículo de prueba y la posible unión no específica en la ausencia de plasma.
- Dependencia de concentración de unión de proteínas: el artículo de prueba se agrega al plasma a cinco concentraciones y se centrifuga según el procedimiento de ultracentrifugación. El ultracentrifugado se analizará para detectar el artículo de prueba.