Inhibición de enzimas

La inhibición de enzimas citocromo P450 (CYP) y enzimas UGT es una de las principales causas de las interacciones entre fármacos de gran importancia clínica (ver DDI). El potencial inhibidor de un artículo de prueba se evalúa mediante la determinación de su efecto en el metabolismo de sustratos de prueba selectivos para enzimas CYP humanas en incubaciones basadas en microsomas de hígado humano agrupados. Es posible profundizar la caracterización de la cinética enzimática de inhibidores y los datos generados se pueden usar para predecir si pueden ocurrir DDI importantes desde el punto de vista clínico luego de la administración del fármaco. 

Consideraciones reglamentarias para los estudios de inhibición enzimática

Las pautas sobre interacciones entre fármacos (DDI) de la FDA y la EMA recomiendan estos estudios para generar datos sobre la inhibición reversible (directa) e irreversible (dependiente del tiempo) de citocromo P450 antes de proceder con los ensayos que se realizan por primera vez en humanos. Los datos de inhibición se usan para determinar el requisito y el alcance de estudios clínicos de DDI.


Método

  • Sistema de prueba: microsomas de hígado humano (HLM) agrupados
  • Enzimas CYP evaluadas: CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6,CYP2E1 y CYP3A4/5
  • Enzimas UGT evaluadas en ensayos de inhibición directa a pedido: UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT11A6, UGT1A9, UGT2B7, UGT2B15 
  • Concentraciones de artículos de prueba: 8 concentraciones por triplicado
  • Todas las preparaciones e incubaciones de muestras se llevan a cabo mediante un sistema automatizado de manipulación de líquidos Hamilton Microlab Star

La inhibición de CYP se mide en ensayos directos y dependientes. Se usa un sustrato selectivo de CYP a una concentración que alcanza la mitad de la velocidad de reacción máxima (Km) para cada enzima CYP (ver a continuación). Se usan inhibidores conocidos como controles positivos para ensayos de inhibición directa y dependiente del metabolismo. Todas las incubaciones concluyen con la incorporación de acetonitrilo refrigerado, que contiene un estándar de metabolitos internos con marcado estable específico para el sustrato de CYP.

Inhibición directa

Los ensayos se llevan a cabo en ausencia y presencia de 8 concentraciones del artículo de prueba para determinar el potencial de inhibición y definir una IC50 donde sea posible.

Es posible profundizar la caracterización de la inhibición directa al determinar la constante de inhibición (Ki) y el tipo de inhibición observado, mediante el uso de 5 concentraciones del sustrato de prueba.

Inhibición dependiente del tiempo (irreversible)

Se incuban los ensayos con 8 concentraciones del artículo de prueba en ausencia y presencia de NADPH por 30 minutos antes de la dilución en un compuesto de sustrato de prueba. Si se observa una inhibición dependiente del tiempo notable, es posible determinar parámetros cinéticos adicionales, que incluyen la constante de inactivación (kinact) y la constante de inhibición (KI). Estos parámetros, que se determinan de forma experimental a través de la variación del tiempo previo a la incubación y la concentración de inhibidores, pueden ayudar a definir el potencial de interacciones entre fármacos.

Condiciones para los ensayos de inhibición de CYP

 

 

 

Controles positivos

Citocromo P450

Sustrato

Analito

Inhibición directa

Inhibición dependiente del tiempo

CYP1A2

Fenacetina

Acetaminofén

Fluvoxamina

Furafilina

CYP2B6

Bupropion

Hidroxibupropión

Orfenadrina

TioTEPA

CYP2C8

Amodiaquina

Desetilamodiaquina

Montelukast

Gemfibrozil 1-O-β-glucuronido

CYP2C9

Diclofenaco

4'-hidroxi diclofenaco

Sulfafenazol

Ácido tienílico

CYP2C19

Mefenitoína

4'-hidroxi mefenitoína

Nootkatona

Esomeprazol

CYP2D6

Dextrometorfano

Dextrorfano

Quinidina

Paroxetina

CYP3A4/5

Testosterona

6β-hidroxitestosterona

Ketoconazol

Eritromicina

CYP3A4/5

Midazolam

1'-hidroximidazolam

Ketoconazol

Troleandomicina

 

Productos finales

Estos ensayos proporcionarán los valores de IC50 para la inhibición directa o irreversible de enzimas CYP. Si se observa una inhibición directa significativa, se puede determinar la constante de inhibición (Ki). Si se observa una inhibición dependiente del tiempo significativa, se pueden determinar los parámetros de inactivación basados en los mecanismos (KI y kinact). Con estos parámetros, la farmacometría puede ofrecer orientación adicional a la hora de evaluar la necesidad de un ensayo clínico.