Inducción de enzimas

• Sistema de prueba: hepatocitos de donantes humanos individuales, criopreservados
• Enzimas CYP evaluadas: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4/5.
• Concentraciones de artículo de prueba: seleccionadas para abarcar exposiciones clínicas previstas (0,1 - 10X C_max), a menos que haya una limitación por la solubilidad. Se seleccionan 5 concentraciones para citotoxicidad, 7 para inducción de mARN y 3 para inducción de actividad enzimática
• Tiempo de incubación: 72 horas, con renovación de medios cada 24 horas.

Citotoxicidad

En ensayos preliminares, se cultivan hepatocitos de un donante en la presencia del artículo de prueba (cinco concentraciones) o tamoxifeno de control positivo (50 µM) en pocillos triplicados por 72 horas en una incubadora humidificada a 37 °C en 5 % de CO2, con intercambios de medios ± artículos de prueba o controles cada 24 horas. Pasadas las 72 horas se evaluará la viabilidad de los hepatocitos usando el ensayo MTS. Los resultados se usarán para determinar las concentraciones no tóxicas del artículo de prueba para los ensayos de inducción.

Estabilidad

En conjunto con el ensayo de citotoxicidad, se recogen muestras de medios para evaluar las concentraciones del artículo de prueba con el tiempo.

Inducción de mARN CYP

Se incuban hepatocitos de tres donantes en la presencia o ausencia del artículo de prueba (siete concentraciones) o inductores de control (ver abajo) en pocillos triplicados por 72 horas en una incubadora humidificada a 37 °C en 5 % de CO2, con cambio de medios ± artículo de prueba o controles cada 24 horas. Pasadas 72 horas, se extrae mARN para determinar la expresión génica mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El nivel de cada mARN CYP se normaliza con el del gen de control endógeno (por ej., GAPDH). Luego se calcula el factor multiplicador de inducción de la expresión génica de CYP usando el método 2-ΔΔCT. Un aumento en niveles de mARN CYP dependiente del artículo de prueba de ≥2 veces en relación al vehículo de control, o una respuesta de ≥20 % de la respuesta a controles positivos, pueden interpretarse como resultados positivos.

Inducción de enzimas CYP

Se cultivan hepatocitos de tres donantes en la presencia o ausencia del artículo de prueba (tres concentraciones) o inductores de control (como arriba) en pocillos triplicados por 72 horas en una incubadora humidificada a 37 °C en 5 % de CO2, con cambio de medios ± artículo de prueba o controles cada 24 horas. Pasadas 72 horas, los hepatocitos se incuban en un medio nuevo que contiene los sustratos CYP apropiados (ver abajo) por 2 horas. Después se terminan las reacciones y se recogen muestras para el análisis de metabolitos (ver abajo) usando un método analítico de cromatografía de líquidos-espectometría de masas (LC-MS). Un aumento en niveles de actividad de enzimas CYP dependiente del artículo de prueba de ≥2 veces en relación al vehículo de control, o una respuesta de ≥20 % de respuesta a controles positivos, se pueden interpretar como resultados positivos.