5 tipos diferentes de ensayos de liberación de citocinas: cómo superar la situación | Publicación II de CRA

En nuestra publicación anterior, explicamos los peligros del síndrome de liberación de citocinas (CRS) y la importancia de los ensayos preclínicos de liberación de citocinas (CRA) al desarrollar anticuerpos monoclonales (mAb) que interactúan con el sistema inmunológico del paciente. En esta segunda publicación, describimos los diferentes tipos de ensayos en uso y cómo pueden adaptarse a su programa de desarrollo farmacológico. Un tipo de CRA alternativo, el cocultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células endoteliales circulantes de crecimiento tardío (BOEC), se analizará en mayor detalle en la próxima publicación de nuestro blog.

Algunas preguntas que debería considerar a la hora de elegir el CRA más apropiado incluyen las siguientes:

  • ¿El compuesto tiene una región Fc que puede unirse a receptores Fc gamma neonatales en células endoteliales?
  • ¿El compuesto se une a más de una diana?
  • ¿La expresión de la diana incluye sujetos sanos?
  • ¿Qué citocinas debería medir, ya que no todas las citocinas aumentan durante una tormenta de citocinas?

Ensayos de sangre total

Los ensayos de sangre total son uno de los CRA más utilizados. Su principal ventaja es que replican las condiciones in vivo con mucha aproximación. El formato del ensayo recrea las frecuencias del subconjunto de células inmunitarias, la distribución celular de FcyR y los niveles de expresión a niveles fisiológicos, lo cual revela vínculos entre el genotipo de FcyR y la magnitud de la liberación de citocinas en respuesta al tratamiento con mAb.

El CRA de sangre total es mucho más sensible que el CRA de PBMC de fase sólida (ver a continuación) para alemtuzumab (anticuerpo anti-CD52), que estimula la liberación de citocinas mediada por FcγRI. Sin embargo, los CRA de sangre total no son sensibles a la liberación de citocinas con muromonab-CD3 y TGN1412 (superagonista anti-CD28). Otros estudios han determinado que un formato de ensayo de sangre total es preferible a los ensayos de PBMC para la detección de liberación de citocinas mediante oligonucleótidos que se unen a receptores tipo Toll.

PBMC de humanos

Las PBMC están compuestas por el aislamiento puro de linfocitos (células T, células B, células NK) y monocitos. Se extraen de la sangre total y, por ende, el ensayo es menos relevante a nivel fisiológico que los CRA de sangre total, pero puede ser más sensible al hallazgo de una señal de citocinas.

Se demostró que los CRA de fase sólida, que implican la coincubación de PBMC con mAb recubiertos en seco sobre una placa de cultivo de tejidos, pueden predecir el potencial de liberación de citocinas de TGN1412. En la fase líquida, los ensayos de PBMC no producen entrecruzamientos de dianas ni unión de FC. Otros análisis de fase sólida incluyen el recubrimiento en húmedo de los mAb sobre el plástico de cultivo de tejidos a una menor densidad que la presentada a través del recubrimiento en seco. Todos los procedimientos anteriores se usan para imitar la presentación fisiológica de mAb, pero en última instancia son diferentes a la presentación in vivo e implican desventajas lamentables respecto a la tasa de falsos positivos y el fondo elevado de los ensayos. Las presentaciones con recubrimiento en seco y húmedo también se aplican al ensayo de sangre total.   

CRA de alta densidad

Tal como lo describió por primera vez Romer et al en 2011, los precultivos de PBMC a alta densidad mejoran la sensibilidad del ensayo para detectar la activación terapéutica de células T. Las PMBC de alta densidad responden de manera similar a las células semejantes a las de los nódulos linfáticos en comparación con los ensayos de PBMC regulares de baja densidad. Este ensayo no inicia el entrecruzamiento de dianas ni la unión de FC. Sin embargo, a diferencia de los ensayos de PBMC tradicionales, el sistema de este ensayo se puede usar para detectar respuestas positivas a TGN1412 en fase soluble o líquida debido a que las células se encuentran en un estado "estimulado" como las células de los nódulos linfáticos.  

Cocultivo de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) y PBMC

Este ensayo produce entrecruzamiento de dianas y unión de FC. Las células endoteliales habitualmente se desarrollan en las venas umbilicales, que se usan como la interfaz con PBMC para las pruebas de liberación de citocinas. Como los ensayos están compuestos por una mezcla heteróloga de células, esto puede generar incompatibilidad de los tejidos (cuando las células de un donante se mezclan con las de otro) y podría ser la causa de algunas de las limitaciones de los ensayos con cocultivo de HUVEC/PBMC.

Cocultivo de células endoteliales circulantes de crecimiento tardío (BOEC) y PBMC

Este ensayo autólogo produce entrecruzamiento de dianas y unión de FC.  Este formato de ensayo, descrito por primera vez en 2015 por Mitchelle, et al, es similar en concepto al ensayo de HUVEC con una diferencia menor. Las BOEC son células endoteliales crecidas a partir de PBMC recolectadas del mismo donante. Como este ensayo es completamente autólogo, no genera problemas de incompatibilidad de tejidos, lo que mejora la sensibilidad del ensayo. Hasta la fecha, el sistema de este ensayo es el más efectivo de los sistemas in vitro para replicar el microambiente vascular in vivo. Un importante beneficio del sistema de este ensayo, a diferencia de otros formatos, es que el agente terapéutico biológico se presenta de una manera más relevante a nivel fisiológico, semejante a la dosificación. Este ensayo tiene un sistema patentado y actualmente Covance es la única OIC que lo ofrece comercialmente.

Diseño típico de estudio

Dado que los niveles absolutos de las citocinas producidas varían según el ensayo CRA utilizado, puede ser difícil identificar un resultado positivo verdadero. Por lo tanto, los estudios de liberación de citocinas deberían incluir controles positivos y negativos pertinentes. La selección de anticuerpos monoclonales de control depende del mecanismo de acción del producto analizado; por ejemplo, muromonab-CD3 o TGN1412 para productos dirigidos a células T; alemtuzumab o rituximab para productos con función efectora citotóxica o fitohemaglutinina para un control positivo de mitógenos.

El estudio también debería usar productos de sangre obtenidos de varios donantes (se recomienda un mínimo de 10) para conseguir una mezcla natural de muestras fisiológicas. Si la diana no está presente en muestras de donantes sanos, se sugiere llevar a cabo estudios híbridos con donantes sanos y muestras derivadas de pacientes. Se deben seleccionar sugerencias para la elección de dosis compuestas según la ocupación de receptores de la diana y, como mínimo, se debe considerar una dosis elevada, media y baja.   

Desafíos de los formatos de ensayo actuales

No todas las plataformas de CRA pueden discernir entre los mAb que inducen una liberación de citocinas suave o moderada, ni tampoco se pueden utilizar para determinar un límite donde los niveles de citocinas liberadas pueden estar ligados a eventos adversos graves en humanos. Los CRA aún no predicen con totalidad la liberación de citocinas y su precisión depende de los tipos de anticuerpos que se analizan. Por este motivo, los investigadores continúan buscando formatos de CRA mejorados.

Obtenga más información sobre cómo Covance puede respaldar su proceso no clínico.

¿Se perdió la primera publicación de nuestra serie? Lea nuestra publicación introductoria sobre ensayos de liberación de citocinas in vitro aquí.

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