Actualización sobre el uso preclínico de hPBMC para modelos de inmuno-oncología

AUTOR:

Sheri Barnes, Ph.D.

FECHA:

Julio de 2020


En febrero presentamos los datos iniciales de la plataforma de ratón humanizado emergente de Covance que utiliza el injerto de células mononucleares de sangre periférica humana (hPBMC).

Con nuestros datos usando el ratón NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) se identificaron cuatro donantes de hPBMC que exhibieron una ventana de tratamiento de al menos 30 días tras la inyección de hPBMC, prendimiento de células T consistente y crecimiento de dos modelos de xenoinjerto humano, MiaPaCa-2 (pancreático) y A549 (CPCNP), que fue robusto en ratones NSG injerctados con hPBMC.

Ahora presentamos los datos de eficacia inicial que demuestran el uso de ratones NSG injertados con hPBMC y con xenoinjertos de MiaPaCa-2 o A549 tras el tratamiento con pembrolizumab (Keytruda®, anti-hPD-1).

Diseño experimental

El objetivo de estos estudios fue evaluar la respuesta antitumoral del pembrolizumab contra los modelos tumorales humanos MiaPaCa-2 o A549 tras el injerto de hPBMC en ratones NSG. Para el cuidado y uso de animales en instalaciones con acreditación de AAALAC, se siguieron las pautas de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

A los ratones NSG (Jackson Laboratories, Bar Harbor Maine, EE. UU., variedad n.° 0005557) se les administró por vía intravenosa hPBMC de tres donantes sanos normales diferentes (Hemacare, Los Ángeles, CA, EE. UU.) una vez establecidos los tumores (~105-118 mm3). El tratamiento con pembrolizumab se inició el día después a la inyección de hPBMC. Se evaluó la respuesta a pembrolizumab, se determinó la aparición de características similares a la de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) y se extrajo sangre entera en dos oportunidades para el análisis por citometría de flujo de marcadores de linfocitos humanos para confirmar el prendimiento de células CD45+, incluyendo células T CD4+ y  CD8+.

Crecimiento de tumor de control MiaPaCa-2 y A549 en ratones injertados con hPBMC

El tiempo de duplicación (Td) del tumor MiaPaCa-2 en los animales de control sin tratar fue de ~7 días, el Td en animales inyectados con hPBMC varió entre ~5 y 7 días en los grupos de cada donante.

Los tumores crecieron uniformemente hasta un volumen tumoral promedio de 1000-1200 mm3 para el día 36 entre los tres donantes; sin embargo, se vio cierta variabilidad intragrupo e intergrupo pasado el día 36. El crecimiento tumoral antes de los 1000 mm3 no parece haberse visto afectado por el injerto de hPBMC (figura 1).

Estos resultados sugieren que la utilización de cualquiera de estos tres donantes sería apta para estudios de eficacia con MiaPaCa-2 con un tiempo hasta el tamaño de evaluación (TES) de 1000 mm3.

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Figura 1. Crecimiento de control de tumores subcutáneos MiaPaCa-2 tras administración de hPBMC

 

El Td de A549 en animales de control sin tratar fue de ~11 días, el Td en animales inyectados con hPBMC varió entre 9 y 12 días en los grupos de cada donante.

Los tumores crecieron uniformemente hPBMC de los donantes 1 y 3 hasta un volumen tumoral promedio de 1000-1200 mm3 para el día 40 con cierta variabilidad pasado el día 40. 

La variabilidad intragrupo fue más evidente en aquellos ratones con tumores A549 y hPBMC del dontante 2 (imagen 2). 

Estos resultados sugieren que los donantes 1 y 3 son más aptos para estudios de eficacia con A549 con un TES de 1000 mm3.

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Fgura 2. Crecimiento de control de tumores A549 subcutáneos tras la administración de hPBMC

 

Injerto y persistencia de linfocitos humanos

El prendimiento se evaluó el día 28 y luego el día 38 (MiaPaCa-2) o el día 42 (A549) después de la administración de hPBMC mediante un análisis inmunofenotípico de marcadores de células inmunes humanas en la sangre periférica de ratones del estudio. 

Los marcadores de citometría de flujo incluyeron mCD45, hCD45, hCD3, hCD4 y hCD8. Las células CD45+ humanas, como porcentaje de células vivas de animales con tumores MiaPaCa-2 (imagen 3A) o A549 (imagen 3B) se presentan abajo y se usaron como indicador de prendimiento de hPBMC. 

Descubrimos que las células hCD45+ en sangre entera se detectaron en todos los donantes y en ambos puntos temporales, lo que corresponde a la literatura publicada.1

Si bien la variabilidad intragrupo fue evidente, la medida promedio de prendimiento se mantuvo consistente o aumentó entre el primer y el segundo punto temporal. Todo parece indicar que el prendimiento de hPBMC en animales con tumores A549 fue bastante mayor que el de las células injertadas en animales con tumores MiaPaCa-2, algo consistente con nuestros datos de desarrollo de modelo iniciales. 

En este momento se desconoce si esto fue resultado de una variabilidad normal de estudio a estudio o si existe una dependencia del modelo con el prendimiento.  

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Figura 3. Prendimiento de células hCD45+ detectado en sangre entera de ratones NSG inyectados con hPBMC y con xenoinjertos MiaPaCa-2 (A) o A549 (B).

 

La imagen 4 ilustra un ejemplo de distribución de células T CD4+ y CD8+ en sangre entera e ilustra que la distribución de células T fue consistente entre puntos temporales. 

Si bien estos datos solo representan al donante 1 en ratones con tumores MiaPaCa-2, se reportaron datos similares para todos los donantes y modelos estudiados. 

Específicamente, la distribución de células T CD4+ y CD8+ varió entre 42-65 % y 32-46 %, respectivamente, en ratones con MiaPaCa-2, y 51-67 % y 22-44 %, respectivamente, en ratones con A549 (datos no mostrados). 

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Imagen 4. Prendimiento de células T hCD4+ y hCD8+ (como % de células hCD45+) detectado en sangre entera de ratones NSG con MiaPaCa-2 inyectados con hPBMC del donante 1.

 

La aparición de síntomas de EICH se monitoreó por peso corporal y observaciones clínicas; aunque no confirmados patológicamente en estos estudios, los síntomas observados en estos modelos están fuertemente correlacionados con la enfermedad2 y con datos anteriores (datos no mostrados).

Respuesta a pembrolizumab

Resulta interesante que el tratamiento con pembrolizumab en los ratones injertados con hPBMC no afectó el crecimiento tumoral de MiaPaCa-2 ni A549 con ninguno de los donantes bajo las condiciones probadas (imágenes 5 y 6). 

Al momento de la redacción de este artículo, había muy poca literatura sobre la respuesta in vivo a pembrolizumab en ratones humanizados injertados con hPBMC con tumores MiaPaCa-2. 

No obstante, nuestros datos reflejan lo indicado en muchas publicaciones sobre la naturaleza refractaria de los tumores pancreáticos en respuesta a agentes inmuno-oncológicos.3  La respuesta de pembrolizumab contra el tumor A549 parece ser moderada tal como se indicó anteriormente, y esta respuesta parece depender del donante.4

A pesar de la consistente falta de respuesta del pembrolizumab contra A549 o MiaPaCa-2, estos modelos pueden resultar útiles para enfoques terapéuticos usando estrategias de combinación racional con anti-hPD-1 ya que existen amplias posibilidades para mejorar y evaluar las respuestas variadas entre distintos donantes.  

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Figura 5. Crecimiento tumoral de tumores subcutáneos MiaPaCa-2 tras administración de hPBMC y tratamiento con control de isotipo o pembrolizumab (anti-hPD-1)
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Figura 6. Crecimiento tumoral de tumores subcutáneos A549 tras administración de hPBMC y tratamiento con control de isotipo o pembrolizumab (anti-hPD-1)

 

La administración de hPBMC a ratones NSG resulta en la persistencia de células T humanas en los ratones con efectos mínimos en el crecimiento tumoral de MiaPaCa-2 o A549. Este método representa una sólida plataforma preclínica para examinar los efectos de nuevos agentes humanos que aprovechan los linfocitos T humanos para dirigir la actividad antitumoral con una importancia clínica directa.

Con trabajos futuros se demostrará la infiltración de células T humanas en el tumor y periferia por citometría de flujo con tratamiento de inmunoterapias aprobadas por la FDA contra xenoinjertos tumorales humanos en ratones NSG reconstituidos con hPBMC.

Covance cuenta con suministros de estos donantes de PBMC humano disponibles para su investigación.  Póngase en contacto con nuestros científicos de oncología preclínica para ver cómo podría usar ratones NSG injertados con hPBMC en su próximo estudio de inmuno-oncología traslacional.

Referencias:

1.Todd Pearson, Dale L. Greiner y Leonard D. Shultz. "Creation of "Humanized" Mice to Study Human Immunity". 2008. Current Protocols in Immunology, capítulo 15: unidad 15,21

2.Sina Naserian, Mathieu Leclerc, Allan Thiolat, Caroline Pilon, Cindy Le Bret, Yazid Belkacemi, Sébastien Maury, Frédéric Charlotte y José L. Cohen. "Simple, Reproducible, and Efficient Clinical Grading System for Murine Models of Acute Graft-versus-Host Disease". 2018. Front. in Immun. (9): 10.

3.Robert J. Torphy, Yuwen Zhu y Richard D. Schulick. "Immunotherapy for pancreatic cancer: Barriers and breakthroughs". 2018. Ann Gastroenterol Surg. 2(4): 274-281.

4.Shouheng Lin, Guohua Huang Lin Cheng, Zhen Li, Yiren Xiao,Qiuhua Deng,Yuchuan Jiang,Baiheng Li,Simiao Lin,Suna Wang,Qiting Wu,Huihui Yao,Su Cao,Yang Li,Pentao Liu, Wei Wei,Duanqing Pei,Yao Yao, Zhesheng Wen, Xuchao Zhang, Yilong Wu, Zhenfeng Zhang, Shuzhong Cui, Xiaofang Sun, Xueming Qian y Peng Li. "Establishment of peripheral blood mononuclear cell-derived humanized lung cancer mouse models for studying efficacy of PD-L1/PD-1 targeted immunotherapy". 2018. MAbs. 10(8): 1301-1311.