Detección de fosfoproteínas en tumores sólidos a través de la citometría de fosfoflujo

En este artículo presentamos la detección de fosfoproteínas en tumores sólidos usando citometría de fosfoflujo y repasamos el análisis de la inhibición de señalización PI3K/AKT y JAK-STAT inducida por cabozantinib en tumores vs. células inmunes huésped.

El  in vivo efficacy of small molecule inhibitors is often assessed by measuring the phosphorylation state of cell signaling proteins within the pathways the drug targets. Esto puede ser un reto cuando hay que analizar tumores sólidos. En investigaciones preclínicas donde se usan modelos de roedores, los métodos más comunes para analizar tumores son las técnicas basadas en immunoblot y ELISA. Sin embargo, estos métodos de análisis por volumen tienen dos desventajas principales. Su capacidad relativa de medir varias dianas a la vez es subóptima. Y lo que es más importante, no pueden analizar dianas en varios subgrupos diferentes dentro de la muestra tumoral heterogénea. Esto puede ser importante cuando la proteína de señalización diana tiene funciones opuestas en distintos tipos de células en el microambiente tumoral como células inmunes vs. células tumorales, y hasta crítico si los efectos inducidos por el fármaco ocurren en uno pero no en ambos subgrupos.

Labcorp has developed a novel phospho-flow-based platform that simultaneously analyzes multiple cell signaling targets in both the host immune cell and the tumor cell compartments derived from solid tumors. Esto se logra distinguiendo las células tumorales de las células inmunes huésped que se infiltran mediante inmunotipificación del marcador celular pan-hematopoyético CD45, antes del análisis de fosfoproteínas. Para demostrar la utilidad de esta plataforma, se midieron los niveles de STAT5 fosforilada y la diana descendente de AKT (S6) en tumores MV-4-11 subcutáneos recolectados de ratones tratados con el inhibidor de FLT3 cabozantinib. La imagen 1 revela que el cabozantinib reduce los niveles de pS6 y pSTAT5 las células tumorales (h)CD45+ humanas. No se observaron cambios en los niveles de estas fosfoproteínas en las células inmunes huésped (m)CD45+ de ratones (no se muestra). Por lo tanto se puede ver la actividad de señalización de PI3K/AKT y JAK-STAT, que son vías bien documentadas que regulan tanto el crecimiento tumoral como la inmunidad del huésped, y son dianas atractivas para una intervención terapéutica.

Imagen 1: Análisis de fosfoflujo de señalización de STAT5 y MAPK en tumor sólido.

El MV-4-11 es un modelo de leucemia mieloide aguda (LMA), un cáncer causado por una mutación genética en uno de varios genes. El evento más común ocurre en el gen FLT3, que resulta en una proteína FLT3 constitutivamente activa que genera la proliferación de células cancerosas al desencadenar la hiperactivación de señales PI3K/AKT y JAK-STAT.¹ Se ha demostrado que la inhibición de FLT3 mediada por cabozantinib frena el crecimiento del tumor MV-4-11 in vivo, lo que está correlacionado con una inhibición de las señales AKT y STAT in vitro.² Aunque está bien documentado que las señales PI3K/AKT y JAK-STAT5 hiperactiva generan el crecimiento tumoral en muchos modelos, la actividad de estas proteínas de señalización también es necesaria para la activación de las células T y la generación de formación de células T de memoria.^3,4,5 Esta dicotomía enfatiza la importancia de poder analizar simultáneamente las fosfoproteínas tanto en células tumorales como en células inmunes derivadas de tumores sólidos.

Tumor phospho-flow at Labcorp has potential to advance the cell signaling field. El fosfoflujo de tejidos sólidos se describió en 2010 en tumores pulmonares y peritoneales.⁶ Desde entonces, los informes de otros métodos exitosos han sido escasos. Más recientemente, un método llamado DISSECT se combinó con citometría y se usó con éxito para medir fosfoproteínas en muestras de tejido epitelial, y más tarde en tumores colorrectales^.7,8 Cabe destacar que estos métodos requieren fijación después de recolectar el tejido, lo que puede alterar los epítopos ligados por los anticuerpos fluorescentes usados tanto para la inmunotipificación como para el análisis de señales. Esto puede limitar la cantidad de datos que generan las técnicas. Solid tumor phospho-flow at Labcorp does not require fixation, prior to immuno-staining. Esto facilita nuestra capacidad de analizar poblaciones diferentes. Estamos trabajando para ampliar nuestras prestaciones. Actualmente nos estamos enfocando en el desarrollo de nuevos servicios de fosfoflujo en tumores sólidos que permitan el análisis de los efectos inducidos por un tratamiento in vivo en subgrupos de células T específicos y células tumorales simultáneamente.

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Referencias

²Lu, J. W.; Wang, A. N.; Liao, H. A.; Chen, C. Y.; Hou, H. A.; Hu, C. Y.; … & Lin, L. I. (2016). Cabozantinib is selectively cytotoxic in acute myeloid leukemia cells with FLT3-internal tandem duplication (FLT3-ITD). Cancer letters, 376(2), 218-225.

³Vara, J. Á. F.; Casado, E.; de Castro, J.; Cejas, P.; Belda-Iniesta, C.; & González-Barón, M. (2004). PI3K/Akt signalling pathway and cancer. Cancer treatment reviews, 30(2), 193-204.

⁴Rani, A. y Murphy, J. J. (2016). "STAT5 in cancer and imCantrell, D". (febrero de 2002).

⁵Protein kinase B (Akt) regulation and function in T lymphocytes. In Seminars in immunology (Vol. 14, No. 1, pp. 19-26). Academic Press.

⁶Lin, C. C.; Huang, W. L.; Su, W. P.; Chen, H. H.; Lai, W. W.; Yan, J. J.; & Su, W. C. (2010). Single cell phospho‐specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho‐Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry Part A, 77(11), 1008-1019.

⁷Simmons, A. J.; Banerjee, A.; McKinley, E. T.; Scurrah, C. R.; Herring, C. A.; Gewin, L. S.; … & Irish, J. M. (2015). Cytometry‐based single‐cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF‐α‐induced apoptosis in vivo. Molecular systems biology, 11(10), 835.