Medición de inmunidad específica a un antígeno tumoral con ELISpot y FluoroSpot

AUTOR:

David Draper

FECHA:

Marzo de 2020

 

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La mejora de la respuesta a un antígeno tumoral específico es un resultado previsto de la inmunoterapia. Ya sea a través de un aumento agudo en la inmunidad antitumoral o la formación de memoria inmunológica duradera, los fármacos que aumentan satisfactoriamente la respuesta inmune adquirida del anfitrión tienen mayores probabilidades de tener éxito clínico1. Si bien hay muchos ensayos disponibles para medir la especificidad antigénica, muchos de estos tienen limitaciones ya que necesitan el uso de reactivos específicos para el modelo, animales genéticamente modificados o pasos de purificación de subgrupos celulares. Oncología Preclínica de Covance ofrece una solución asequible y simple a través del análisis ELISpot/FluoroSpot.

ELISpot y FluoroSpot usan tecnología basada en ELISA tipo sándwich para medir la frecuencia de células que producen y liberan dianas solubles. Hay kits comerciales disponibles para medir dianas que incluyen citocinas, quimiocinas, inmunoglobulinas, factores de crecimiento y más. En Covance ofrecemos análisis de inmunospot vinculado a encimas con un solo color de una sola diana (ELISpot) así como también análisis basado en fluorescencia multicolor de hasta 3 dianas simultáneamente (FluoroSpot). En la imagen 1 se muestra un esquema que ilustra el procedimiento FluoroSpot para el análisis de células que producen IFNγ e IL-4 específicas de tumores.

Imagen 1: procedimiento ELISpot/FluoroSpot
Imagen 1: procedimiento ELISpot/FluoroSpot

En este artículo destacado sobre tecnología demostramos la aplicación de  ELISpot/FluoroSpot en investigación de inmuno-oncología preclínica usando el modelo de carcinoma hepatocelular murino Hepa1-6-luc (Imagen 2). Para esto, usando FluoroSpot, medimos la inmunidad a tumores específicos en la sangre periférica de ratones con tumores y se demostró que la inhibición de puntos de control in vivo con un tratamiento con anti-PD-1 aumenta la cantidad de células específicas del tumor circulantes que producen IFNγ. Asimismo, el anti-PD-1 cambia el perfil de citocinas IFNγ/IL-4 de una respuesta inmunosupresoria hacia una más proinflamatoria y distintivo antitumoral.

Imagen 2: análisis FluoroSpot de inmunidad antitumoral en ratones con tumores Hepa1-6-luc. Los ratones C57BL/6 con tumores Hepa1-6-luc establecidos recibieron dosis de anti-PD-1 o anticuerpos de control de isotipo. Se cultivaron glóbulos blancos de 200µL de sangre periférica con células Hepa1-6-luc irradiadas. A) Cuantificación de la frecuencia de células secretoras de IFNγ e IL-4 usando un analizador CTL ImmunoSpot® S6 Universal. B) Análisis de la frecuencia de células que producen IFNγ vs. el volumen del tumor en cada ratón. C). Equilibrio Th1/Th2 en cada ratón evaluado mediante medición de la  proporción de células que producen IFNγ/IL-4.
Imagen 2: análisis FluoroSpot de inmunidad antitumoral en ratones con tumores Hepa1-6-luc. Los ratones C57BL/6 con tumores Hepa1-6-luc establecidos recibieron dosis de anti-PD-1 o anticuerpos de control de isotipo. Se cultivaron glóbulos blancos de 200µL de sangre periférica con células Hepa1-6-luc irradiadas. A) Cuantificación de la frecuencia de células secretoras de IFNγ e IL-4 usando un analizador CTL ImmunoSpot® S6 Universal. B) Análisis de la frecuencia de células que producen IFNγ vs. el volumen del tumor en cada ratón. C). Equilibrio Th1/Th2 en cada ratón evaluado mediante medición de la  proporción de células que producen IFNγ/IL-4.

Similar al mecanismo de acción para una vacuna, un tumor que va creciendo provoca una respuesta inmune adaptiva que consiste en células específicas del tumor que producen citocinas1. La calidad de la respuesta se puede caracterizar al examinar que, tal como está bien documentado, IFNγ e IL-4. IFNγ inhiben el crecimiento tumoral al mejorar las células T por medio de la citotoxicidad. En contraste, IL-4 promueve el crecimiento tumoral a través de una variedad de efectos inmunosupresores. Esta dicotomía se suele denominar equilibrio Th1/Th22. Como se muestra en la imagen 2, el anti-PD-1 aumentó la frecuencia de células con respuesta tumoral que producen IFNγ tras la estimulación ex vivo. En contraste, la frecuencia de células que producen IL-4 no aumentó significativamente, lo que sugiere que la inhibición de los puntos de control desencadenó una mejora de la inmunidad de protección antitumoral. Para respaldar esto, los ratones con las más altas frecuencias de células que producen IFNγ albergaron tumores de menor volumen. Asimismo, el anti-PD-1 aumentó la proporción de células que producen IFNγ/IL-4, algo que también fue más pronunciado en los ratones con los tumores más pequeños.

En conjunto, este conjunto de datos demuestra cómo el análisis ELISpot/FluoroSpot puede revelar otros efectos farmacológicos en la respuesta inmune frente a tumores específicos. Además, como el ensayo se puede realizar con pequeñas cantidades de sangre, ELISpot/FluoroSpot se puede aplicar a ramas de eficacia longitudinalmente. Por lo tanto, se ofrece la oportunidad de acceder a una perspectiva mecanicista de la actividad farmacológica sin añadir una segunda rama de muestras al estudio. Para acceder a más información sobre cómo el análisis ELISpot/FluoroSpot se puede aplicar a su investigación de oncología e inmuno-oncología preclínica, póngase en contacto con Oncología Preclínica de Covance.

Referencias:

1. Immunity; 52,1 (2020): 36-54

2. Cancer Immunology, Immunotherapy; 57,8 (2008): 1125-1136.