Análisis funcional de linfocitos infiltrantes de tumor por citometría de flujo mediante el panel Cytokine/Cytotoxicity™

AUTOR:

David Draper, PhD

FECHA:

Agosto de 2020

Las respuestas a citocinas proinflamatorias combinadas con la expresión de granzimas B y CD107a (LAMP-1) son muy valiosas en el campo de la inmuno-oncología1-3. Los ensayos basados en células que pueden cuantificar la expresión de estas dianas en linfocitos efectores derivados de tumores nos permiten analizar el mecanismo de acción de los candidatos farmacológicos. El Grupo de Oncología Preclínica de Covance ofrece un nuevo ensayo ya listo para usar que utiliza el panel de citometría de flujo estándar Cytokine/Cytotoxicity para cuantificar estos parámetros en subgrupos de células T, células exterminadoras naturales (NK) y células T exterminadoras naturales (NKT). En este artículo sobre tecnología mostramos cómo el panel Cytokine/Cytotoxicity™ se puede incorporar a estudios in vivo y, combinado con inmunotipificación convencional, ayuda a generar conjuntos de datos sólidos durante el desarrollo farmacológico preclínico.

Las citocinas, incluso las IFNγ, TNFα y IL-2, tienen actividad antitumoral al promover la activación de células inmunes innatas y adaptivas y la proliferación de células T en el microambiente tumoral.Las terapias in vivo que inhiben el crecimiento tumoral mediante la activación de las células T, a través de mecanismos directos o indirectos, a menudo aumentan la frecuencia de células T que se infiltran en el tumor y que están predispuestas a responder vigorosamente a la estimulación ex vivo. Se ha demostrado que ocurre un efecto similar en células NK y NKT con respecto a la predisposición y subsecuente producción de IFNγ/TNFα. Además de la producción de citocinas, el tratamiento in vivo puede hacer que los linfocitos efectores adquieran propiedades citotóxicas intensificadas que generan una lisis de células tumorales mediante mecanismos de contacto directo de célula con célula. Este proceso es mediado por la expresión y liberación de perforinas y granzimas de gránulos citolíticos almacenados dentro de las células inmunes. Estas toxinas alteran la membrana celular e inducen la apoptosis en la célula tumoral diana. Asimismo, la degranulación coincide con la expresión de CD107a en la superficie de la célula efectora y por lo tanto se puede usar como marcador de actividad citotóxica.

Juntos, los distintivos descritos arriba se pueden perfilar para examinar el estadio de activación de subgrupos de linfocitos en el microambiente tumoral. El panel Cytokine/Cytotoxicity permite realizar estas mediciones al combinar inmunotipificación de superficie celular usando anticuerpos específicos de células T, NK y NKT con tinción intracelular para la expresión de citocinas y granzimas B (cuadro 1).

Cuadro 1: Panel Cytokine/Cytotoxicity™

Anticuerpo/tinte

Descripción

CD45

Marcador de células pan-hematopoyéticas

CD3

Marcador de células pan-T

CD4

Marcador de células T CD4+

CD8

Marcador de células T CD8+

CD49b/CD335

Marcador de células exterminadoras naturales/T exterminadoras naturales

IFNγ

Citocina proinflamatoria

TNFα

Citocina proinflamatoria

IL-2*

Activador de células T

Granzima B

Marcador de citotoxicidad

CD107a

Marcador de degranulación

Tinte de viabilidad

Exclusión de células muertas

*IL-2 se puede sustituir con otras citocinas como IL-4 y IL-17a

 

Análisis de citocinas y granzimas B en células efectoras derivadas de tumor 4T1-luc tras terapia con anti-mCTLA-4 y radiación

La utilidad del panel Cytokine/ Cytotoxicity para medir las citocinas y granzimas B se demuestra en este conjunto de datos usando el modelo de carcinoma mamario 4T1-luc murino. La figura 1 muestra la estrategia de gating usada para delinear subgrupos de células T y células NK. Al igual que con todos nuestros paneles de citometría de flujo para oncología preclínica, el análisis comienza con la exclusión de células muertas y la subsiguiente delineación de células inmunes CD45+ para identificar subgrupos inmunes de interés (los datos no se muestran). Se muestran perfiles representativos de expresión de  IFNγ, TNFα, IL-2 y granzimas B tras estimulación con PMA/ionomicina. 

Figura 1: gating de citocinas proinflamatorias y granzimas B en subgrupos de linfocitos por citometría de flujo
Figura 1: gating de citocinas proinflamatorias y granzimas B en subgrupos de linfocitos por citometría de flujo

El microambiente del tumor 4T1-luc es altamente inmunosupresor y está caracterizado por la presencia de un gran infiltrado de células supresoras derivadas de células mieloides granulocíticas (los datos no se muestran). Está comprobado que el 4T1-luc es un modelo resistente a terapias de inhibición de puntos de control. Sin embargo, al combinarse con radiación administrada con la Small Animal Radiation Research Platform (SARRP, Xstrahl), el anticuerpo anti-mCTLA-4 mejora la inhibición de crecimiento tumoral de tumores 4T1-luc (imagen 2A, izquierda). Es probable que la inhibición del crecimiento tumoral no se deba a un aumento en el reclutamiento de células efectoras inducido por el tratamiento ya que la citometria de flujo no muestra un aumento en el recuento de células T o células NK en el tumor tras ninguna condición de tratamiento in vivo en comparación con el grupo de control de isotipo (imagen2A, derecha). Sin embargo, la estimulación ex vivo de células derivadas del tumor con PMA/ionomicina revela que las células T CD8+ tienen una mayor capacidad de producir IFNγ. Además, las células NK expresan mayores niveles de granzimas B en comparación con los controles (imagen 2B). Estos datos sugieren que un tratamiento combinado con radiación y anti-mCTLA-4 mejoran el estadio de activación de las células T CD8+ y las células NK. Esto demuestra el valor de incluir marcadores mecanísticos en estudios orientados a la eficacia e inmunotipificación.

Figura 2: panel Cytokine-Cytotoxicity
Figura 2: análisis de la respuesta proinflamatoria en células efectoras en el modelo 4T1-luc. Ratones BALB/c con tumores 4T1-luc establecidos (n=6/grupo) se dosificaron con anti-mCTLA-4 (clon 9D9), radiación focalizada ("RAD"; SARRP, Xstrahl Inc.), una combinación de ambos o anticuerpos de control de isotipo. Los tumores se disociaron en suspensiones celulares individuales (gentleMACS™, Miltenyi Biotec) y se etiquetaron con anticuerpos fluorescentes antes de la adquisición de datos. Para el análisis de citocinas y granzimas B, las células derivadas del tumor se estimularon ex vivo con PMA/ionomicina por 5 horas en presencia de brefeldin A. Tras la incubación, las células se recogieron y se les hizo inmunotinción para dianas intracelulares. Los datos se adquirieron en un citómetro de flujo Attune™ NxT (ThermoFisher Scientific) y luego se analizaron usando el software Flowjo (BD).

 

Análisis de degranulación en células efectoras derivadas de tumor CT26 tras terapia con anti-mCTLA-4

CD107a se expresa en la superficie celular durante la degranulación y es un marcador comúnmente usado para medir los efectos inducidos por el tratamiento en la actividad citotóxica. El panel Cytokine/Cytotoxicity™ se usó para examinar los efectos del anti-mCTLA-4 en la citotoxicidad de linfocitos y crecimiento tumoral en el modelo de carcinoma colorrectal CT26 murino. Los ratones con tumores CT26 tratados con anti-mCTLA-4 responden con una inhibición del crecimiento tumoral del 74 % (imagen 3A). Para examinar la citotoxicidad, se midió la expresión de CD107a y granzimas B en células T CD8+, NK y NKT tras la estimulación ex vivo de células derivadas del tumor con PMA/ionomicina. Los perfiles de expresión representativos se muestran en la imagen 3B. El análisis revela que el tratamiento con anti-mCTLA-4 desencadena un aumento en la expresión de CD107a en los tres subgrupos en comparación con los animales tratados con el control de isotipo. Esto coincide con una disminución en los niveles de expresión de granzimas B en células NK y NKT. Los datos sugieren que las granzimas B almacenadas en células NK y NKT se reducen durante la degranulación. Cabe destacar que no hubo diferencia en la expresión de granzimas B en células T CD8+ entre grupos quizás por un equilibrio en la expresión de novo de granzimas B desencadenada por el tratamiento y la velocidad de degranulación. En conjunto, este fenotipo es consistente con una mejora en toxicidad inducida por el tratamiento y presenta el potencial de generar una actividad de exterminación de células tumorales directa.

Figura 3: paneles Cytokine-Cytotoxicity
Figura 3: análisis de citotoxicidad en el modelo CT26. Ratones BALB/c con tumores CT26 establecidos (n=10/grupo) se dosificaron con anticuerpos anti-mPD-1 (clon RMP1-14) o de control de isotipo. La inmunotipificación y estimulación ex vivo se realizaron tal como se describe arriba.

 

Personalización: configuración del panel para personalizar respuestas de citocinas

El panel Cytokine/Cytotoxicity™ está preconfigurado para medir citocinas proinflamatorias. El panel también se puede personalizar para examinar otras respuestas de citocinas. Por ejemplo, las células T CD4+ colaboradoras se diferencian en fenotipos efectores CD4+ diferentes, que incluyen Th1, Th2 y Th17. Estos subgrupos tienen distintos roles en la patogénesis del tumor. Las células Th1 están caracterizadas por la liberación de IFNγ, mientras que las Th2 y Th17 se pueden caracterizar por la producción de IL-4 y IL-17 respectivamente. El panel Cytokine/Cytotoxicity™ se puede personalizar para incluir IL-4 y IL-17A y facilitar el análisis mecanístico de los efectos inducidos por el tratamiento en las células T colaboradoras en el microambiente tumoral.

Póngase en contacto con los científicos de Covance para acceder a más información sobre cómo el panel Cytokine/Cytotoxicity™ se puede incorporar a su investigación de oncología preclínica.

El cuidado y uso de animales se ejecutó de conformidad con las normativas de bienestar animal en un centro acreditado por la AAALAC con revisión y aprobación de protocolo del IACUC.

 

1. Clynes, R. A. y Desjarlais, J. R. (2019). "Redirected T cell cytotoxicity in cancer therapy". Annual Review of Medicine70, 437-450.

2. Miller, J. S. y Lanier, L. L. (2019). "Natural killer cells in cancer immunotherapy". Annual Review of Cancer Biology3, 77-103.

3. Bae, E. A., Seo, H., Kim, I. K., Jeon, I. y Kang, C. Y. (2019). "Roles of NKT cells in cancer immunotherapy". Archives of Pharmacal Research, 1-6.