Determinar la persistencia de células CAR-T mediante citometría de flujo

Durante la investigación y el desarrollo preclínicos, a menudo se investigan las terapias de células T con CAR (receptores de antígenos quiméricos) con ratones como sujetos de prueba. En este entorno, los ratones inmunocomprometidos llevan una carga tumoral de origen humano y se les administran células CAR-T humanas alogénicas. Las células transferidas de forma adoptiva son dirigidas por el receptor de antígenos quiméricos manipulado para unirse a un antígeno de superficie de una célula tumoral (CD19, por ejemplo). Como resultado de la unión de la célula T manipulada a la célula tumoral, la célula T se activa y destruye las células tumorales sin restricciones del CMH. Se hace un seguimiento de los ratones en estudios de investigación preclínica para analizar varios parámetros predefinidos que permiten evaluar el crecimiento y la carga tumoral a fin de determinar la eficacia de las células CAR-T (Vea más información sobre cómo se puede determinar la eficacia mediante imagenología por bioluminiscencia (BLI)

Un factor de éxito fundamental de la respuesta antitumoral de las células CAR-T es el tiempo que viven las células CAR-T luego de su infusión en el huésped (persistencia). A pesar de la funcionalidad total, se ha demostrado que una mala persistencia de células CAR-T puede limitar una respuesta tumoral efectiva.1  En el entorno clínico, la remisión a largo plazo de pacientes con neoplasias hematológicas está ligada a la persistencia sostenida de células CAR-T.2 Se cree que la señalización de coestimuladores influye en la expansión y persistencia de las células T. Los estudios preclínicos que investigan la eficacia de los constructos de CAR manipulados para incluir el dominio coestimulador 4-1BB se han asociado con una persistencia prolongada de células CAR-T, una función efectora más lenta y sostenida y una mayor proporción de células T de memoria.3 Evaluar la persistencia de células CAR-T en estudios preclínicos influye en el éxito clínico.

Este artículo destacado sobre tecnología brindará información al lector sobre la medición de la persistencia de células CAR-T mediante citometría de flujo durante la fase preclínica.

Modelos de ratones para la evaluación de candidatos para células CAR-T

En septiembre de 2017, la Administración de Medicamentos y Alimentos aprobó la primera terapia con células CAR-T. La terapia celular es comercializada por Novartis y se llama Kymriah. Kymriah también se conoce como tisagenlecleucel y fue aprobada para niños y adultos jóvenes que ya no responden a terapias estándar para la leucemia linfoblástica aguda de células B. La terapia Kymriah está basada en el trabajo de Carl June, PhD en ratones NSGTM en la Universidad de Pensilvania.

El ratón NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, conocido generalmente por el nombre de la marca, NOD scid gamma (NSG™), no expresa el gen Prkdc ni el gen Il2rg ligado al cromosoma X. La mutación en la scid (inmunodeficiencia combinada severa) se encuentra en la proteína Prkdc del complejo de reparación del ADN y produce una deficiencia de células B y T en los ratones. Estos ratones no tienen células del sistema del complemento ni células exterminadoras naturales (NK) y presentan una deficiencia en las vías de señalización de citocinas. Debido a estas deficiencias, los ratones son ideales y altamente susceptibles al injerto de células inmunes humanas, incluidas las células CAR-T. Se injerta una amplia variedad de tumores humanos en los ratones y son el método por excelencia para la investigación preclínica de células CAR-T.

En nuestro departamento de Oncología Preclínica podemos usar cualquier variedad de ratones comercialmente disponibles para estudios de terapias con células CAR-T y otros estudios de transferencia adoptiva de células, incluso ratones NSGTM, y bajo ciertas condiciones podemos aceptar ratones especiales.

El panel PersistenceTTM del área de Oncología Preclínica se usa para generar datos longitudinales de persistencia de células CAR-T y se puede usar con tan solo 5 uL de sangre entera. Está diseñado como ensayo con protocolo de lisado/no lavado y recuentos absolutos. El panel tiene flexibilidad y ofrece la oportunidad de agregar sensores anti-CAR específicos en los canales FITC, PE y APC. A los ratones NSG de Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, EE. UU.) se les administró 2x107 PBMC humanas, se les extrajo sangre 7, 14 y 21 días luego de la administración y se sometieron a la evaluación del panel PersistenceTTM.

La tabla 1 describe los reactivos que se utilizan en el panel PersistenceTTM. La estrategia de gating se detalla en la figura 1.

Anticuerpo/tinte

Descripción

mCD45

Células pan-hematopoyéticas de ratón

hCD45

Células pan-hematopoyéticas humanas

hCD3

Marcador de células pan-T humanas

hCD4

Marcador de células T CD4+ humanas

hCD8

Marcador de células T CD8+ humanas

Microesferas de recuento

Ofrece conteos absolutos

Tinte de viabilidad

Exclusión de células muertas

Opcional: específico de CAR

FITC, PE o APC

Tabla 1: panel PersistenceTTM de anticuerpos y descripción de su uso.

 

archivo
Figura 1: análisis de células T humanas mediante el uso del panel PersistenceTTM. La estrategia de gating comienza con la doble exclusión (A) y luego avanza a la combinación de fluorescencia de microesferas con un gate de recuento de microesferas (B). A continuación, se excluyen los restos (C) y se distinguen las células de ratón de las células humanas mediante el uso de anti-CD45 de ratón con anti-CD45 de humano (D). Se aíslan las células T humanas a través del gating con anti-CD3 de humanos (E) y, finalmente, se determina la cantidad de células T CD8+ y CD4+ humanas (F).

Caracterización inmunofenotípica longitudinal de células CAR-T mediante el uso del panel PersistenceTTM

En el entorno de oncología clínica, la expansión y persistencia de las células CAR-T se correlacionan con la respuesta y con conseguir la remisión en los pacientes.4 Debido a esta observación, establecer métodos confiables para rastrear las cantidades de células CAR-T tiene especial importancia, no solo para calcular la efectividad de la terapia con células CAR-T, sino también para evaluar la seguridad en el entorno preclínico. Se advierten efectos secundarios graves en la terapia con células CAR-T y uno de los más importantes es el síndrome de liberación de citocinas (CRS), que se asocia con la expansión de células CAR-T in vivo.5 

El panel PersistenceTTM es directamente aplicable a la evaluación de cantidades de células CAR-T humanas en muestras extraídas de ratones a lo largo del tiempo. Debido a los bajos requisitos de sangre entera, es posible obtener muestras del mismo ratón varias veces o a través del uso de cohortes de ratones para lograr los objetivos de los estudios. Los ratones NSG se pueden usar para estudios de larga duración para evaluar la persistencia de células CAR-T de forma específica. La figura 2 muestra un ejemplo de cómo se puede usar el panel PersistenceTTM para medir las células T humanas en ratones NSG a lo largo del tiempo.

Figura 2. Medición de persistencia de células T humanas en ratones a lo largo de 21 días.
Figura 2. Medición de persistencia de células T humanas en ratones a lo largo de 21 días.

Mejorar la persistencia de células CAR-T

La persistencia de células CAR-T in vivo es un marcador secundario de la eficacia clínica a largo plazo de la terapia con células CAR-T. Los estudios han demostrado que ciertas células CAR-T que contienen un dominio coestimulador CD28 muestran una mayor expresión de genes relacionados con el agotamiento de células T, mientras que el dominio coestimulador 4-1BB (TNFSF9) con la misma especificidad antigénica redujo el fenotipo agotado. Esto puede ayudar a explicar por qué, en ensayos clínicos de pacientes con leucemia linfoblástica aguda recidivante o refractaria, se ha informado que las células CAR-T que expresan un dominio CD28 persisten hasta 3 meses, mientras que las células CAR-T con un dominio 4-1BB persisten hasta 5 años, y más de 6 meses en casi todos los casos que se pudieron evaluar.6

Células CAR-T a lo largo de las generaciones

Las células CAR-T siguen evolucionando mediante la modificación del receptor de antígenos quiméricos. Cada célula CAR-T tiene un scFv (fragmento Fv monocatenario variable). El scFv es una combinación de los dominios de la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL). Un scFv es una proteína de fusión de la VH y VL de las inmunoglobulinas, conectada con un péptido de enlace corto de entre 10 y 25 aminoácidos.

Los CAR de primera generación tienen un dominio de unión extracelular, una región bisagra, un dominio transmembrana y uno o más dominios de señalización intracelular. Todas las células CAR-T tienen el dominio de cadena  CD3 ζ para la señalización intracelular y es el principal transmisor de señales de activación de células T. La incorporación de un dominio coestimulador (CD28 o 4-1BB) definió los CAR de segunda generación. El objetivo era mejorar la proliferación de células T, la secreción de citocinas y la persistencia in vivo.

Los datos preclínicos muestran que los CAR de tercera generación tienen una mejor función efectora y una persistencia in vivo más prolongada en comparación con los CAR de segunda generación. Los CAR de tercera generación tienen varios dominios coestimuladores (CD28-41BB o CD28-OX40). Las células CAR-T de cuarta generación a veces se denominan CAR "armados" y TRUCK (siglas en inglés de "células CAR-T redirigidas para la exterminación universal de citocinas"). Las células CAR-T de cuarta generación pueden incluir factores que mejoran la expansión de células T, la actividad antitumoral y la persistencia.7

Independientemente de la generación CAR o TRUCK, el panel PersistenceTTM es una excelente herramienta para la monitorización a corto o largo plazo de la persistencia in vivo de células CAR-T en el entorno preclínico.

Resumen

Medir la persistencia de células CAR-T es sencillo con el panel PersistenceTTM. Nuestro panel de citometría de flujo permite determinar la persistencia longitudinal de células CAR-T a partir de un pequeño volumen de sangre. Nuestro panel Human CompTTM (tabla 2) es un excelente ejemplo de cómo se pueden agregar otros paneles calificados a un estudio preclínico de células CAR-T para la generación de conjuntos exhaustivos de datos de citometría de flujo.


Anticuerpo/tinte

Descripción

hCD45

Células pan-hematopoyéticas humanas

hCD3

Marcador de células pan-T humanas

hCD4

Marcador de células T CD4+ humanas

hCD8

Marcador de células T CD8+ humanas

hCD25

Marcador de células T reguladoras humanas

hFoxP3

Marcador de células T reguladoras humanas

hPD-1

Proteína de señalización de inhibidores de células T humanas

hCD69

Marcador de activación

Ki-67

Marcador de proliferación

Tinte de viabilidad

Exclusión de células muertas

Tabla 2. Marcadores individuales del panel de leucocitos Human CompTTM.

 

Para obtener más información sobre cómo se puede incorporar el panel PersistenceTTM o uno de nuestros otros paneles de citometría de flujo en sus investigaciones de oncología preclínica y conocer más sobre nuestro extenso programa de citometría de flujo, comuníquese con los científicos.

El cuidado y uso de animales se ejecutó de conformidad con las normativas de bienestar animal en un centro acreditado por la AAALAC con revisión y aprobación de protocolo del IACUC.


1Song DG, Ye Q, Carpenito C, Poussin M, Wang LP, Ji C, Figini M, June CH, Coukos G, Powell DJ Jr.  In vivo persistence, tumor localization, and antitumor activity of CAR-engineered T cells is enhanced by costimulatory signaling through CD137 (4-1BB).

Cancer Res. Jul. de 2011 1;71(13):4617-27.

2Maude SL, Frey N, Shaw PA, Aplenc R, Barrett DM, Bunin NJ, et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med. 2014;371(16):1507–17. 

3Long AH, Haso WM, Shern JF, Wanhainen KM, Murgai M, Ingaramo M, et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nat Med. 2015;21:581–90.

4Porter DL, Hwang WT, Frey NV, Lacey SF, Shaw PA, Loren AW, et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Sci Transl Med. 2015;7(303):303ra139. 

5Santomasso B, Bachier C, Westin J, Rezvani K, Shpall EJ.  The Other Side of CAR T-Cell Therapy: Cytokine Release Syndrome, Neurologic Toxicity, and Financial Burden.

Am Soc Clin Oncol Educ Book. Ene. de 2019; 39:433-444. 

6Maus MV and June CH.  Making Better Chimeric Antigen Receptors for Adoptive T-cell Therapy. Clin Cancer Res. Abril de 2016 15; 22(8): 1875-1884.

7Chmielewski M, Abken H. TRUCKs: the fourth generation of CARs. Expert Opin Biol Ther. 2015;15(8):1145-54. 


AUTOR:

Mark J Cameron | Director de Desarrollo Científico 

FECHA:

Noviembre de 2020

 

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