Análisis celular dendrítico integral por citometría de flujo a través del uso del nuevo panel CompDC™

Para abordar la creciente necesidad de inmunotipificación de CD integral en modelos murinos preclínicos, Covance ha configurado un nuevo panel estándar, CompDC™. En este artículo destacado sobre tecnología demostraremos cómo se puede usar este panel para analizar diversos subgrupos de CD en muestras de células tumorales y derivadas de otros tejidos.

AUTOR:

David Draper, PhD | Subdirector, Desarrollo Científico

FECHA:

 Febrero de 2019

 

Las respuestas antitumorales mediadas por células T dependen de la actividad de la células presentadoras de antígenos (CPA) que presentan el antígeno asociado al tumor (AAT) y envían señales coestimuladoras a las células T. Esto a su vez activa las células T específicas del tumor, desencadenando su expansión y reclutamiento al tumor donde ejercen sus efectos. Las células dendríticas (CD) son CPA profesionales que son fundamentales en este proceso. Las CD se pueden activar para expresar numerosos ligandos de moléculas coestimuladoras y pueden internalizar el antígeno y presentar péptidos inmunodominantes tanto a las células T CD4+ como a las CD8+. El desarrollo de nuevas terapias que aprovechan la función de las CD es un área de investigación intensiva. Para facilitar este trabajo y abordar la creciente necesidad de inmunotipificación de CD integral en modelos murinos preclínicos, Covance ha configurado un nuevo panel estándar, CompDC™. En este artículo destacado sobre tecnología demostraremos cómo se puede usar este panel para analizar diversos subgrupos de CD en muestras de células tumorales y derivadas de otros tejidos.

Para ver una introducción general a los distintos subgrupos de CD y su función en biología de cáncer, lea nuestro blog reciente "Una introducción al análisis y biología de células dendríticas usando modelos de inmuno-oncología singénicos"

Con el panel CompDC™ los investigadores pueden determinar si la terapia in vivo afecta la abundancia y el estado de activación de diferentes subgrupos de CD en el tumor, ganglios linfáticos (GL) que drenan el tumor u otros compartimentos huésped. Se trata de un panel de 12 colores que combina un conjunto de anticuerpos que, cuando se lo examina adecuadamente, delinea los distintos subgrupos de CD y deja ver el potencial de activación de células T de las CD (cuadro 1). Mediante una meticulosa estrategia de gating, el panel primero facilita el análisis de CD con precisión al excluir macrófagos, granulocitos y células B usando un gate (portal) de exclusión. Este proceso minimiza el riesgo de que el análisis de CD se vea comprometido por la contaminación con células irrelevantes o autofluorescentes. Luego se usa la expresión de CD24 para delinear los subgrupos de CD convencionales, que generalmente se clasifican por niveles de expresión medios a altos de CD11c y CMH clase II. Estas CD convencionales incluyen el subgrupo DC1 CD103+/CD8+ y el subgrupo DC2 CD11b+ (imagen 1A), que según lo demostrado generan respuestas antitumorales de las células T CD8+ y CD4+ respectivamente.[1] La expresión de XCR1 se ha documentado en varios grupos como un marcador para CD con actividad de presentación cruzada, un fenotipo requerido para la activación de células T CD8+ mediada por CD.[2] Las imágenes 1B y 1C demuestran el análisis de CD XCR1+ en células derivadas del tumor B16-F10 y ganglios linfáticos de drenaje. La expresión de XCR1 suele estar asociada al subrupo DC1, tal como se muestra. Por último, se mide la expresión de marcadores de maduración CD80 y CD86 para evaluar el potencial coestimulador de células T de las CD. La imagen 1D muestra que la expresión de estos marcadores es relativamente baja en CD en tumores de melanoma B16-F10, un indicio de la imunosupresión impartida en las CD por el microambiente tumoral (MAT).

  

Anticuerpo/tinte Descripción
CD45 Marcador de células inmunitarias pan

F4/80, Ly-6G, CD19

Gate de exclusión para macrófagos, granulocitos y células B
CD11c Marcador de células dendríticas
CD24 Marcador de células dendríticas
CD8 Marcador de DC1
CMH clase II Marcador de células dendríticas/marcador de maduración
CD103 Marcador de DC1
CD11b Marcador de DC2
XCR1 Marcador de células dendríticas migratorias/de presentación cruzada
CD80 Marcador de maduración
CD86 Marcador de maduración
Tinte de viabilidad Exclusión de células muertas
El panel CompDC™ se puede personalizar para analizar subgrupos de CD inflamatorias (CDinf) y CD plasmacitoides sustituyendo los anticuerpos Ly-6C/CD206 y Siglec-H respectivamente.

Figura 1: análisis de subgrupos de CD usando el panel MI-CompDC™.
Figura 1: análisis de subgrupos de CD usando el panel CompDC™. Se recolectaron tumores tipo melanoma B16-F10 de ratones. Análisis de subgrupo de DC1 y DC2 en células derivadas de tumores (A), expresión de XCR1 en células DC1 CD103+ en el tumor (B) y ganglios linfáticos (GL) de ratones con tumores B16-F10 (C). Expresión de marcadores coestimuladores CD80 y CD86 en el total CD derivadas de tumores (D). El pico rojo representa las células con tinción objetivo. El pico azul representa el control negativo sin tinción.

 

El panel CompDC™ también se puede personalizar para analizar dos subgrupos de CD adicionales. Esto incluye CD inflamatorias (CDinf) y el análisis se realiza sustituyendo los anticuerpos anti-CD206 y anti-Ly-6C. Se ha demostrado que las CDinf promueven actividad antitumoral y se pueden delinear fuera del gate de células supresoras derivadas de mieloides monocíticas (CSDM-M) como células CD11c+MHCII+CD11b+CD206+ (imagen 2A).[3] También se pueden cuantificar las CD plasmocitoides (CDp) al sustituir un anticuerpo anti-Siglec-H. Si bien la función de las CDp en el MAT no se ha caracterizado por completo, muchos informes indican que estas CDp pueden tener una función reducida e incluso un efecto inmunosupresor en las respuestas antitumorales.[4] Las CDp suelen tener bajos niveles de expresión de CD11c y son positivas apra Siglec-H, como se muestra en la imagen 2B.

  

Figura 2: análisis de subgrupos CDInf y CDp mediante la personalización del panel CompDC™. (A) Análisis de CDInf en células derivadas del tumor B16-F10. (B) Análisis de CDp en células derivadas de carcinoma colorrectal CT26.
Figura 2: análisis de subgrupos CDInf y CDp mediante la personalización del panel CompDC™. (A) Análisis de CDInf en células derivadas del tumor B16-F10. (B) Análisis de CDp en células derivadas de carcinoma colorrectal CT26.

 

Póngase en contacto con los científicos de Covance para acceder a más información sobre el panel CompDC™ y cómo incorporarlo en su investigación.

1Gardner, A. y Ruffell, B. (2016). "Dendritic cells and cancer immunity". Trends in immunology37(12), 855-865.

2Wylie, B., Seppanen, E., Xiao, K., Zemek, R., Zanker, D., Prato, S., … y Waithman, J. (2015). "Cross-presentation of cutaneous melanoma antigen by migratory XCR1+ CD103− and XCR1+ CD103+ dendritic cells". Oncoimmunology4(8), e1019198.

3Kuhn, S., Yang, J. y Ronchese, F. (2015). "Monocyte-derived dendritic cells are essential for CD8+ T cell activation and antitumor responses after local immunotherapy". Frontiers in immunology6, 584.

4Mitchell, D., Chintala, S. y Dey, M. (2018). "Plasmacytoid dendritic cell in immunity and cancer". Journal of Neuroimmunology.

 

Nota: Los estudios se realizaron de conformidad con la normativa de bienestar animal vigente en un establecimiento con acreditación de AAALAC