Un análisis más profundo de inmunofenotipo de linfocitos T infiltrantes

En este artículo destacado sobre tecnología demostramos una de nuestras prestaciones más nuevas presentando datos generados usando el nuevo panel Expanded CompT™, un panel de 16 colores que lleva al análisis de flujo de activación y diferenciación de células T a un nivel por encima de cualquier otro panel en la cartera de servicios de Covance.

AUTOR:

David Draper, PhD | Subdirector, Desarrollo Científico

FECHA:

Agosto de 2019

La citometría de flujo que emplea grandes paneles de anticuerpos tiene la ventaja de analizar una mayor cantidad de subgrupos de células. Esta capacidad tiene una importancia particular cuando se requieren datos exhaustivos, pero el material tumoral disponible para análisis es limitado. Asimismo, los paneles con una gran cantidad de anticuerpos también se pueden usar para habilitar datos inmunofenotípicos extensos de algunos subgrupos o un análisis aún más profundo de un solo subgrupo. En este artículo destacado sobre tecnología demostramos una de nuestras prestaciones más nuevas presentando datos generados usando el nuevo panel Expanded CompT™, un panel de 16 colores que lleva al análisis de flujo de activación y diferenciación de células T a un nivel por encima de cualquier otro panel en la cartera de servicios de Covance.

El panel Expanded CompT™ se construyó sobre la base del panel CompT™, nuestro panel estándar más popular para el análisis de células T CD4+ y CD8+. Este panel mejorado añade marcadores de células T efectoras y de memoria y cuatro marcadores adicionales para el análisis de la activación y el agotamiento de células T. La tabla 1 describe los componentes del panel Expanded CompT™ y, mediante el uso de adenocarcinomas de colon MC38 murinos sin tratar, la figura 1 ilustra su estrategia de gating y análisis.

  

Anticuerpo/tinte Descripción
CD45 Marcador de células inmunitarias pan
CD3 Marcador de células pan-T
CD4 Marcador de células T CD4+
CD8 Marcador de células T CD8+
FoxP3 Marcador de células T reguladoras
CD25 Marcador de células T reguladoras/receptor IL-2
CD44 Marcador de activación/memoria
CD62L Marcador de células T vírgenes/memoria
Ki-67 Marcador de proliferación
CD69 Marcador de activación de células T
PD-1 Marcador de activación/agotamiento de células T
LAG-3 Marcador de activación/agotamiento de células T
TIM-3 Marcador de agotamiento de células T
ICOS Marcador de activación de células T
Granzima B Marcador de citotoxicidad antitumoral
Tinte de viabilidad Exclusión de células muertas
El panel Expanded CompT™ se puede adaptar para incluir marcadores de células NK/NKT (CD49b/CD335) y permitir la expresión de marcadores de activación y granzima B en estos subgrupos.


Al igual que con todos los paneles de células T de Covance, el análisis comienza con la exclusión de células muertas y la posterior delimitación de células inmunitarias CD45+ hasta el gate en células T CD3+ (no se muestra). La figura 1A muestra los criterios de valoración descendentes del análisis de células T CD4+ y CD8+ que tienen en común los paneles CompT™ y Expanded CompT™. Estos incluyen CD69 y PD-1, que aumentan al momento de la activación de células T. Su expresión se ha correlacionado con el fenotipo de células T agotadas.[1] Otro criterio de valoración en común es la proliferación de células T CD8+, que se logra mediante el uso de la expresión de Ki-67 como marcador secundario. Finalmente, se analizan las células T CD4+ para cuantificar las células T colaboradoras y las células T reguladoras (Treg). Las figuras 1B y 1C ilustran los criterios de valoración adicionales que se usan para ampliar el modelo CompT™, los cuales se describen en mayor detalle a continuación.

 

Fig. 1: análisis de células T mediante el panel Expanded CompT™
Fig. 1: análisis de células T mediante el panel Expanded CompT™. Se recolectaron tumores MC38 sin tratar de ratones C57BL/6. (A) cuantificación de células CD4+ colaboradoras, células T CD8+ y Treg, incluida la medición de proliferación (análisis de Ki-67) y la expresión de marcadores CD69/PD-1. (B) Análisis de células T CD8+ efectoras/de memoria para cuantificar los subgrupos de células vírgenes, Teff, Tem y Tcm. (C) Análisis ampliados de marcadores de activación/agotamiento de células T, incluida la granzima B. Los picos rojos representan las células diana con tinción. Los picos azules representan los controles negativos sin tinción.


El análisis de diferenciación de células T CD8+ efectoras y de memoria se muestra en la figura 1B. La conversión de células T en un fenotipo de memoria es importante para el desarrollo de una respuesta inmunológica duradera a la reexposición en el contexto de patogénesis de infección y cáncer. El análisis de CD44 y CD62L permite la delimitación de células T en cuatro estados de diferenciación. Estos incluyen las células T vírgenes o inactivadas, las células T efectoras activadas (Teff) y los subgrupos de memoria efectora (Tem) y memoria central (Tcm). Los subgrupos Tem y Tcm pueden circular pero tienen tendencias a residir en tejidos no linfoides y linfoides, respectivamente.[2] Informes recientes han demostrado que ambos subgrupos desempeñan funciones distintas en la respuesta antitumoral. Más recientemente se indicó que una tercera población de memoria residente (Trm) tiene un papel fundamental en el control del crecimiento tumoral en una variedad de modelos y se puede delimitar mediante el uso de CD103, entre otros marcadores.[3] El panel Expanded CompT™ se puede adaptar para incluir el análisis de células Trm.

  

El panel Expanded CompT™ incluye el análisis de ICOS, LAG-3, TIM-3 y granzima B, que son cuatro biomarcadores muy investigados para analizar la funcionalidad de las células T (figura 1C). El análisis de estas dianas por sí solas y en conjunto puede aportar datos sobre el potencial antitumoral de las células T CD8+. La evidencia respalda una función coestimuladora y antitumoral para la señalización del receptor ICOS, lo cual convierte a ICOS en una diana terapéutica atractiva.[4] La granzima B generalmente se utiliza como biomarcador de actividad citolítica y se puede correlacionar con las respuestas antitumorales de las células T CD8+. En cambio, PD-1, LAG-3 y TIM-3 son receptores inhibidores y, si bien la expresión de estos tres receptores se ha vinculado con el agotamiento de células T, una cantidad de datos cada vez mayor sugiere que hay heterogeneidad entre las subpoblaciones dentro de las células T CD8+ con expresión de PD-1.[5] Esta heterogeneidad tiene una correlación con el patrón de expresión de estos receptores inhibidores. Este perfil puede ayudar a definir diferentes subpoblaciones con el potencial distintivo de revigorizarse para proliferar y/o destruir células tumorales.[6] La figura 2 ilustra cómo el panel Expanded CompT™ puede cuantificar células con una expresión positiva doble y triple de receptores inhibidores y aportar datos sobre el subgrupo heterogéneo de células T con expresión de PD-1 y su funcionalidad. Se han descrito y vinculado como factores influyentes en las respuestas inmunes de tumores a varios otros receptores de activación de células T y receptores inhibidores; estos incluyen a TIGIT, OX-40, CD137, CTLA-4 y otros. Covance tiene experiencia en el análisis de muchos de estos marcadores en análisis tumorales ex vivo. Con mínimos esfuerzos de desarrollo, el panel Expanded CompT™ se puede adaptar para satisfacer sus necesidades preclínicas únicas.

Análisis multiplexado de marcadores de activación/agotamiento de células T en células derivadas de tumores MC38 sin tratar.
Fig. 2: análisis multiplexado de marcadores de activación/agotamiento de células T en células derivadas de tumores MC38 sin tratar. El panel Expanded CompT™ mide la coexpresión de varios biomarcadores de células T para el agotamiento y la actividad antitumoral simultáneamente. En este ejemplo, primero se practicó el gating de células T PD1+ y CD8+. El análisis descendente luego cuantifica las células con expresión positiva doble y triple de PD-1, LAG-3 y TIM-3.


Covance puede configurar paneles adaptados con hasta 18 colores, lo cual permite crear opciones para el panel MI-Expanded CompT™. Además de sustituir o agregar diferentes marcadores de activación y agotamiento de células T tal como se describe en la sección anterior, el análisis de células NK/NKT es un criterio de valoración potencialmente valioso. Esto es posible a través de la incorporación de marcadores CD49b/CD335 al panel (figura 3).

  

Fig. 3: adaptación del panel Expanded CompT™ para permitir el análisis de subgrupos de células NK y NKT en células derivadas de tumores MC38 sin tratar. Se utilizó la expresión de CD3 para delimitar las células NKT y las células NK CD49b/CD335+. Se cuantificaron los niveles de expresión de la granzima B en estos subgrupos mediante el análisis descendente.
Fig. 3: adaptación del panel Expanded CompT™ para permitir el análisis de subgrupos de células NK y NKT en células derivadas de tumores MC38 sin tratar. Se utilizó la expresión de CD3 para delimitar las células NKT y las células NK CD49b/CD335+. Se cuantificaron los niveles de expresión de la granzima B en estos subgrupos mediante el análisis descendente.

 

Las células NK y NKT son una fuente importante de IFNγ, tienen efectos indirectos en las mejoras de las respuestas antitumorales de las células T CD8+ y pueden destruir directamente las células tumorales al liberar gránulos citolíticos tales como la granzima B.[7,8] Otras opciones incluyen IFNγ, TNFα u otros análisis de citocinas para un perfil más exhaustivo de células T PD1+ y PD1-CD8+. También puede agregar el análisis de CD103 para examinar las células T de memoria residente para lograr un perfil más completo de células T de memoria en el tumor. El equipo de Covance tiene amplia experiencia en el desarrollo de servicios adaptados de citometría de flujo. Para obtener más información sobre cómo se puede incorporar el panel Expanded CompT™ en su investigación preclínica, comuníquese con los científicos de Covance.

1Jiang, Y., Y. Li, and B. Zhu. “T-cell exhaustion in the tumor microenvironment.” Cell death & disease 6,6 (2015): e1792.

2Klebanoff, Christopher A., Luca Gattinoni, and Nicholas P. Restifo. “CD8+ T‐cell memory in tumor immunology and immunotherapy.” Immunological reviews 211,1 (2006): 214-224

3Mami-Chouaib, Fathia, et al. “Resident memory T cells, critical components in tumor immunology.” Journal for immunotherapy of cancer 6,1 (2018): 87.

4Amatore, Florent, Laurent Gorvel, and Daniel Olive. “Inducible Co-Stimulator (ICOS) as a potential therapeutic target for anti-cancer therapy.” Expert opinion on therapeutic targets 22,4 (2018): 343-351.

5Miller, Brian C., et al. “Subsets of exhausted CD8+ T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.” Nature immunology 20,3 (2019): 326.

6Xiong, Huizhong, et al. “Coexpression of Inhibitory Receptors Enriches for Activated and Functional CD8+ T Cells in Murine Syngeneic Tumor Models.” Cancer immunology research 7,6 (2019): 963-976.

7Zhu, Yanting, Bo Huang, and Jue Shi. “Fas ligand and lytic granule differentially control cytotoxic dynamics of natural killer cell against cancer target.” Oncotarget 7,3 (2016): 47163.

8Zhao, Jie, et al. “Polyclonal type II natural killer T cells require PLZF and SAP for their development and contribute to CpG-mediated antitumor response.” Proceedings of the National Academy of Sciences 111,7 (2014): 2674-2679.

 

Nota: Los estudios se realizaron de conformidad con la normativa de bienestar animal vigente en un establecimiento con acreditación de AAALAC