Imagenología por bioluminiscencia: monitorización in vivo de desarrollo tumoral, diseminación de la enfermedad y eficacia del tratamiento

AUTOR:

Sylvie Kossodo, PhD |Subdirectora, Desarrollo Científico

FECHA:

Septiembre de 2020

La imagenología por bioluminiscencia (BLI) es una modalidad de imageneología óptica no invasiva diseñada para visualizar y cuantificar la señal bioluminiscente  en tejidos.1 La BLI se basa en la detección de luz visible producida durante la oxidación mediada por enzimas de un sustrato cuando la enzima se expresa in vivo como reportero molecular. La BLI es una alternativa robusta, sensible y de alto rendimiento en comparación con la imagenología tradicional y estudios de biodistribución que usan parámetros terminales, procedimientos invasivos y radioetiquetado. Covance fue la primera OIC en ofrecer BLI en 2003 y en los 17 años desde entonces hemos adquirido una experiencia y conocimientos considerables en este campo de la imagenología óptica. En este artículo destacado sobre tecnología presentaremos los principios de la imagenología por bioluminiscencia y destacaremos las ventajas que ofrece este servicio preclínico en la detección de cáncer, monitoreo de evolución de la enfermedad y evaluación de eficacia antitumoral in vivo.

La BLI requiere que las células expresen luciferasa —una palabra derivada del latín lucifer y que significa "portador de luz"— producida por ejemplo por luciérnagas o pensamientos del mar. El gen luc de luciérnaga se clonó por primera vez en 19852 y, desde entonces, el verde es el color fluorescente más usado en imagenología. La luciferasa de luciérnaga requiere la inyección de su sustrato, D-luciferina, que genera una señal bioluminiscente que alcanza su punto más alto a 562 nm, capturada por una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) de alta eficiencia cuántica que está dentro de un gabinete hermético a la luz. La secuencia de eventos desde la manipulación de células tumorales para que expresen luciferasa hasta la toma de imágenes de animales in vivo se ilustra en la imagen 1. En Covance usamos sistemas de imagenología in vivo IVIS® (PerkinElmer, Waltham, MA) que generan imágenes de BLI in vivo de alta resolución y alta sensibilidad e imagenología por fluorescencia (FLI) en una amplia variedad de longitudes de onda. Se pueden tomar imágenes de hasta cinco animales a la vez bajo los efectos de anestesia 2 % de gas isoflurano. Se inyecta D-Luciferina a cada ratón y se toma la imagen 10 a 15 minutos después de la inyección. La señal BLI se cuantifica en regiones de interés (ROI) trazadas alrededor de tumores, áreas específicas (por ejemplo, craneal, torácica o abdominal), cuerpo entero o tejidos ex vivo y la señal se expresa en fotones por segundo, que representa el flujo que irradia omnidireccionalmente de la región definida por el usuario. Las imágenes se analizan usando el software Living Image 4.3.1 (PerkinElmer, Waltham, MA).

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Imagen 1: Imageneología por bioluminiscencia in vivo usando células vivas luminiscentes. Un vector que transporte un gen luc impulsado por promotor se transfecta a una célula tumoral.  Las células establemente transfectadas se amplían e implantan a un ratón.  Tras el crecimiento del tumor, se inyecta luciferina al animal y se toman imágenes en un sistema de imageneología IVIS bajo anestesia.  Las células luc emiten luz y se pueden rastrear espacial y temporalmente. 

 

Monitoreo de crecimiento de tumor sólido ortotópico

En los últimos 20 años, gracias a la eficacia y sensibilidad de los métodos y herramientas de BLI han surgido una amplísima cantidad de aplicaciones nuevas: estudios de interacciones de proteína-proteína, cribaje genético, reguladores de ciclo celular, infecciones parasitarias, rastreo de prendimiento de células madre, migración de células NK y, por sobre todo, oncología preclínica. Una cantidad significativa de estudios ha demostrado la capacidad de la imagenología BLI de evaluar temporalmente el desarrollo tumoral.3 Esto es particularmente crítico cuando el crecimiento tumoral no se puede determinar con mediciones de calibre y depende ya sea de indicios clínicos como pérdida de peso o de la evaluación de la carga tumoral tras practicar la eutanasia a los animales. En los ejemplos que se muestra abajo, el uso y cuidado de los animales se realizó conforme a las normativas de bienestar animal en un centro acreditado por la AAALAC con revisión y aprobación de protocolos por parte de la IACUC.

Los ejemplos que destacan el valor de la BLI no invasiva en el monitoreo del desarrollo tumoral en tejidos profundos se muestran en la imagen 2. Se implantaron xenoinjertos de carcinoma pulmonar humano NCI-H460-Luc2 ortotópicamente (OT) (1x105 células/ratón) en el pulmón izquierdo de ratones nude hembra.  La BLI (imagen 2, arriba a la izquierda) muestra tumores en la cavidad torácica detectables desde tan solo 8 días después de la implantación de las células tumorales (no visibles en la imagen por haber pasado la señal máxima vista el día 28), y el aumento de la caga tumoral durante las siguientes 2 semanas.  Los ratones sufrieron una pérdida de peso corporal promedio del 18,3 % durante todo el estudio, probablemente relacionado con la enfermedad (no se muestra) y se les practicó la eutanasia 28 días después de la implantación de las células tumorales.  La necropsia reveló un crecimieto significativo del tumor primario y un desarrollo sustancial de masas en toda la cavidad torácica.  En la imagen 2, izquierda abajo, se implantaron células de glioma singeneico murino GL261-luc2 (1x106 células/ratón) intracranealmente a ratones C57BL/6 albinos hembra.Los tumores fueron detectables en los cerebros 7 días después de la implantación.  La pérdida de peso asociada a la evolución de la enfermedad es común en este modelo y fue detectable 11 días después de la implantación del tumor, mientras que el momento de muerte promedio fue aproximadamente a los 21 días.  La línea celular MDA-MB-231-luc-D3H2LN de adenocarcinoma mamario humano forma lesiones óseas tras la inyección intracardíaca (1x105 células/ratón) en ratones nude hembra.  Las lesiones óseas fueron claramente visibles 21 días tras la inyección de células tumorales y tanto la cantidad de tumores como la carga tumoral total aumentó durante las siguientes 3 semanas (imagen 2, derecha, arriba y abajo).  Los ratones sufrieron una pérdida de peso máxima del 16,2 % para el día 32.   La pérdida de peso corporal estuvo relacionada en gran medida con la agresividad del modelo (no se muestra).  El mensaje que rescatamos tras estos estudios es que la BLI puede ser una herramienta muy útil para investigar una variedad de tipos de tumores en tiempo real y de manera no invasiva sin basarnos únicamente en los indicios clínicos de la enfermedad que pueden, o no, acompañar el aumento de la carga tumoral.

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Imagen 2: Imágenes de BLI representativas de varios modelos in vivo. Izquierda arriba: carcinoma pulmonar humano NCI-H460-Luc2 implantado OT (pulmón izquierdo) en ratones nude hembra.  Izquierda abajo: células GL261-luc2 de glioma singeneico murino implantadas OT (cerebro) en ratones C57BL/6 albinos hembra. Derecha: lesiones óseas de tumor mamario humano MDA-MB-231-luc-D3H2LN tras inyección intracardíaca en ratones nude hembra con imágenes de cuerpo entero boca abajo (arriba) y boca arriba (abajo).

 

Imagenología de neoplasias hematológicas

Con más de 80 líneas celulares de neoplasias hematológicas únicas, Covance es el líder de la industria en modelos de neoplasias hematológicas relevantes en el mercado, particularmente pertinente al campo de la terapia celular adoptiva (TCA), también conocida como inmunoterapia celular.4 La BLI tiene un valor crítico al evaluar la evolución y respuesta al tratamiento en neoplasias hematológicamente diseminadas.  Los estudios longitudinales realizados en 4 células cancerosas hematológicas humanas inyectadas IV en ratones NSG indicaron un aumento en la carga turmoral con el paso del tiempo en todos los modelos (imagen 3), lo que subraya el valor de la BLI en la evaluación repetida de la evolución y gravedad de la enfermedad, así como también para comprender la biodistribución de la señal tumoral en todo el cuerpo.

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Imagen 3: Datos de BLI representativos en varias neoplasias hematológicas humanas in vivo tras inyección IV en ratones NSG.

 

La TCA sigue evolucionando y ofreciendo opciones mejores y más personalizadas a los pacientes.  Las células CAR-T son células T autólogas o alogénicas que atacan específicamente antígenos o marcadores expresados por las células tumorales.  La evaluación in vivo preclínica de la eficacia y seguridad de las células CAR-T es crucial antes de introducir estas nuevas terapias en la clínica.  El estudio que se muestra en la imagen 4 se diseñó para evaluar diferentes preparaciones y dosis de CAR-T en células de linfoma de células B Raji-luc B humano implantadas IV en ratones NSG.  Los 3 diseños CAR-T diferentes inhibieron significativamente la carga tumoral y prolongaron la supervivencia, lo que subraya el valor que tiene la BLI para el desarrollo de estas nuevas inmunoterapias celulares.

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Imagen 4: Efecto de terapia con CAR-T contra linfoma de células B Raji-luc implantado IV en ratones NSG.  Arriba: diagrama esquemático de inoculación de células tumorales y terapia con CAR-T.  Abajo: carga tumoral evaluada por BLI y supervivencia general.

 

Monitorización de eficacia de tratamiento

Radiación


Claramente, una de las ventajas clave de la BLI es la capacidad de hacer un seguimiento de la eficacia de terapias antitumorales a través del tiempo en el mismo animal, lo que reduce la cantidad de animales que se tienen que usar.  En el ejemplo que se muestra en la imagen 5, el carcinoma pulmonar de células no pequeñas NCI-H1975-luc se implantó intracranealmente a ratones nude hembra para simular la metástasis pulmonar en el cerebro.  Los ratones recibieron dos rondas de radiación fraccionada (2 Gy; 5 días sí, dos días no por dos ciclos) con un irradiador RadSource RS-2000.  Al grupo de control se le aplicó una radiación simulada.  Las imágenes de BLI se adquirieron a medida que iba transcurriendo el tiempo y demostraron que la radiación redujo significativamente la carga tumoral (imagen 5, p<0,05 el día 19) y hubo un aumento en la expectativa de vida del 160 % (p<0.05, no se muestra).  En este experimento pudimos cuantificar la respuesta al tratamiento in vivo, algo crítico para monitorear la eficacia y para diseñar y mejorar nuevos métodos terapéuticos. 

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Imagen 5: Efecto de tratamiento con radiación localizada (2 Gy; 5 días sí, dos días no por dos ciclos) contra carcinoma pulmonar de células no pequeñas humano NCI-H1975-luc implantado intracranealmente en ratones nude hembra.

 

Inhibición de puntos de control y terapia combinada

El efecto de la inhibición de puntos de control, sola o en combinación con radiación, se probó en células de glioma GL261-luc2 singeneico murino implantadas intracranealmente en ratones C57BL/6 albinos hembra.  Se dejaron ratones sin tratar, otros se trataron con radiación usando la Small Animal Radiation Research Platform (SARRP; Xstrahl Inc.) con una sola dosis de 7,5 Gy, con anticuerpos PD-1 de ratones (clon RMP1-14, 10 mg/kg) o con la combinación de ambas terapias.   Como se muestra en la imagen 6 (izquierda), la señal BLI ya era detectable 6 días tras la implantación de las células tumorales y fue progresando en las semanas siguientes.  La cuantificación de la señal bioluminiscente resultante (derecha) demostró el efecto de los tratamientos en la carga tumoral.  El tratamiento con anti-mPD-1 condujo a un retraso en el crecimiento tumoral de 2,6 días con 1/8 sobreviviente sin tumor (TFS) mientras que con la radiación se consiguió un retraso en el crecimiento tumoral de 16,6 días y 2/8 TFS.  La combinación de radiación y anti-mPD-1 tuvo un retraso significativo en el crecimiento tumoral de 38,6 días y una remisión completa en 7/8 ratones.  Los métodos tradicionales para medir la respuesta antitumoral en cánceres presentes profundo en el cuerpo están basados en lecturas terminales y con frecuencia muy lentas.  Como se muestra en estos ejemplos, la integración de imagenología BLI in vivo nos ha permitido pasar de una "caja negra" de terapia tumoral a la evaluación en tiempo real de respuestas individuales, lo que nos da la flexibilidad de ajustar y mejorar tratamientos con mayor rapidez.

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Imagen 6: Efecto de radiación focalizada, anti-mPD-1 y terapia combinada en tumores GL261-luc intracraneales en ratones albinos C57BL/6 hembra.

 

Multimodalidad

La BLI se puede combinar con otras modalidades de imagenología para analizar distintas vías biológicas.  Para ilustrar esta aplicación, usamos células de adenocarcinoma mamario murino 4T1-luc2-1A4 inyectadas OT en el panículo adiposo mamario de ratones BALB/c inmunológicamente competentes.  Cuando los tumores alcanzaron los ~300 mm3, se inyectó un agente de imagenología casi infrarrojo, ProSenseTM750, por vía intravenosa para detectar la actividad de catepsina asociada al crecimiento del cáncer de mama agresivo.  ProSenseTM750 es un agente ópticamente silencioso que fluoresce en el clivaje con captesinas.  Como se muestra en la imagen 7, las señales tumorales BLI y FLI se pudieron detectar fácilmente en tumores.  Sin embargo, las señales BLI y FLI no fueron perfectamente superponibles, que es de esperar dado que la luciferasa es producida por todas las células tumorales vivas mientras que la señal fluorescente está confinada no solo a las células tumorales sino también a otras células asociadas al tumor, principalmente macrófagos, responsables por el clivaje y absorción de la sonda ProSenseTM750 para captesina.  La multimodalidad por lo tanto se puede usar para evaluar diferentes biologías in vivo simultáneamente.

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Imagen 7: Imágenes multimodalidad de tumores 4T1-luc2-1A4 por BLI (izquierda) y FLI (derecha) 24 horas tras inyección IV de la sonda de fluorescencia ProSenseTM750 específica para captesina.  Abajo se pueden ver acercamientos a los tumores correspondientes.

 

Resumen

Los modelos murinos de cáncer en tejidos profundos y metástasis suelen usarse en evaluaciones terminales como peso tisular, recuento de ganglios y/o análisis histológico para evaluar la carga tumoral.  Desde su introducción hace más de 20 años atrás, la BLI se ha convertido en una técnica invaluable para hacer el seguimiento de la dinámica de crecimiento de líneas celulares cancerosas etiquetadas con bioluminescencia a través del tiempo y en respuesta a distintos métodos terapéuticos in vivo, lo que minimiza la cantidad de animales en el estudio ya que se pueden tomar imágenes de los mismos sujetos a través del tiempo sin necesidad de hacer evaluaciones terminales.  La BLI ha generado aportes importantes a una variedad de campos científicos, además de ofrecer una alternativa al uso de modalidades establecidas de imagenología invasivas o no invasivas pero que dependen de radioisótopos.

Póngase en contacto con los científicos de Covance para solicitar el conjunto completo de datos o más información sobre nuestro servicio de BLI y cómo se puede aplicar a su investigación preclínica.


1Contag CH, Spilman SD, Contag PR, Oshiro M, Eames B, Dennery P, Stevenson DK, Benaron DA. "Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter". Photochem Photobiol 1997; 66: 523-531.

2de Wet JR, Wood KV, Helinski DR, DeLuca M. "Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985; 82, 7870-7873.

3 Jenkins DE, Oei Y, Hornig YS, Yu SF, Dusich J, Purchio T, Contag PR. "Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis". Clin Exp Metastasis, 2003; 20(8):733-744.

4 https://www.cancerresearch.org/immunotherapy/treatment-types/adoptive-cell-therapy