ELISPOT aborda las complejas preguntas que surgen a partir de las vacunas y terapias innovadoras

La rápida llegada de vacunas e inmunoterapias novedosas en el ámbito clínico impulsó el surgimiento de campos como la medicina personalizada, los perfiles inmunológicos y el monitoreo inmunológico, basados en plataformas de pruebas cada vez más sofisticadas. Entre ellos, los inmunoensayos de la familia de ensayos ELISpot (Enzyme-Linked ImmunoSpot, ImmunoSpot vinculado a enzimas) son los ensayos funcionales que se usan con más frecuencia para el análisis de células únicas1.

Cuadro de ELISPOTA partir de datos de 2017 de Trialtrove (Citeline.com), descubrimos que los ensayos ELISpot se utilizaron en más de 160 ensayos clínicos abiertos (figura 1). Los principales factores que contribuyeron al aumento del uso clínico son los siguientes:

  • El aumento en la prevalencia de enfermedades infecciosas y crónicas debido al envejecimiento de la población en países desarrollados
  • El amplio uso de los inmunoensayos para nuevas vacunas e inmunoterapias del ámbito oncológico
  • Los desarrollos tecnológicos, como la automatización de las pruebas y el análisis rápido
  • El crecimiento del sector biotecnológico

Buscar el lugar correcto

En el ensayo ELISpot, una membrana recubierta de anticuerpos en el fondo de microplacas parecidas a las del ELISA captura los analitos secretados por células (citosina, inmunoglobulina, etc.). Después de la extracción de las células, el analito capturado se visualiza a través del depósito de un sustrato con color, lo que resulta en la formación de puntos en la membrana. Los puntos son una representación de las células que secretan el analito en cuestión, la cantidad de analito secretado y su cinética.2 Luego se cuentan los puntos y se generan informes cuantitativos como el de frecuencia de células T específicas por antígeno3 después de la inmunización o tratamiento.4 El ensayo ELISpot para la detección de interferón gamma humano es el ensayo ELISpot de IFN- γ.

ELISpot de IFN-
 γ

La inducción de una función efectora de linfocitos potente resulta central para la actividad de la terapéutica biológica novedosa. Debido a su rol conocido, el IFN-γ se ha convertido en el marcador que predomina en la inducción de respuestas inmunes a nivel celular.5-7 En consecuencia, desde hace dos décadas el ensayo ELISpot de IFN-γ es una plataforma de alta sensibilidad y al mismo tiempo "simple" para detectar y cuantificar la respuesta celular específica a su antígeno. Se ha convertido en la referencia para el análisis de respuestas de las células T para normas de buenas prácticas clínicas de laboratorio.8 Se utiliza en vacunas, trasplantes, tratamientos de VIH, cáncer y alergias, 4,5,6,7 y más. El ensayo ELISpot de IFN-γ cubre casi el 55% de todas las necesidades de utilización de la prueba ELISpot en la evaluación permanente de ensayos clínicos. Por este motivo, y debido a la expansión constante de la industria hacia análisis celulares polifuncionales,9,10 se ha prestado especial atención a la calidad del ensayo ELISpot de IFN- γ.

Pero el ELISpot de IFN-γ es sencillo solo en apariencia. Hay resultados de diferentes paneles de competencia organizados por diferentes organizaciones según los cuales existen diferencias drásticas en los resultados informados por los laboratorios participantes.11,12,13 Existen algunas variables estrictamente controladas que inciden en el resultado del ensayo. Estas incluyen el medio de la prueba, el antígeno (estímulo), las condiciones de almacenamiento de las muestras celulares, la viabilidad de las células, los niveles de capacitación del personal y la metodología de conteo y cuantificación de las microplacas del ELISpot.

Un abordaje integral para el desarrollo, calificación y validación de ensayos ELISpot

La implementación satisfactoria de cualquier solución de pruebas ELISpot durante ensayos clínicos no se produce en forma aislada si es necesario tener controladas las variables del ensayo y la integridad de las muestras. Parte de la solución integrada de pruebas ELISpot de IFN-γ de Covance es un equipo exclusivo dedicado al aislamiento de células objetivo , cuya responsabilidad es procesar/producir el componente celular del ensayo (células sanguíneas mononucleares periféricas, células T, células B, etc.), lo que permite evitar los costos altos de procesamiento de muestras, minimizar el riesgo y otros gastos incurridos al enviar células vivas congeladas a diferentes laboratorios especializados.

De la misma forma, la experiencia en cuestiones reglamentarias, el alcance global y la logística de calidad comprobada, junto con una solución exclusiva y ampliable de ELISpot con volúmenes de pruebas crecientes en función de las necesidades del estudio específico, resultan fundamentables para el éxito de un programa de ensayos clínicos en el que se utiliza ELISpot. En sus laboratorios centrales (CLS), Covance ofrece una amplia variedad de pruebas en el área de la genómica, citometría de flujo e histología, todas bajo el mismo paraguas, ya que estas pruebas generan datos que se complementan mutuamente con los ensayos en los que se utilizan pruebas ELISpot. Esto permite a los patrocinadores crear perfiles inmunológicos funcionales que capturen el estado de inmunidad celular general de los sujetos del ensayo clínico.

Covance ofrece pruebas ELISpot de IFN-γ desde hace varios años en nuestros laboratorios de soluciones de biomarcadores traslacionales. Pero lo más importante es que Covance acaba de incorporar la funcionalidad de pruebas ELISpot de IFN-γ a nuestro laboratorio de vacunas e inmunoterapias novedosas (dentro de los CLS) en Indianápolis, y ofrece así a los patrocinadores una misma solución única para cualquier ensayo que requiera pruebas clínicas ELISpot de IFN-γ en sus programas.

Posicionados para el futuro

Además de la cuantificación colorimétrica tradicional de las citosinas secretadas, la plataforma ELISpot de Covance permite el desarrollar y llevar adelante ensayos FluorSpot multiplexados (figura 2), la próxima generación del ELISpot, que permiten la medición simultánea de diferentes analitos..14,15 La capacidad de validar los novedosos ensayos FluoroSpot con la metodología modular permitirá contar con una oferta lista para usar flexible que reduce los tiempos de desarrollo para los antígenos y objetivos específicos de cada patrocinador. La plataforma de ELISpot en el laboratorio de vacunas y terapias inmunológicas novedosas de Covance está en una posición ideal para contribuir a los próximos desarrollos en este campo.


Referencias
1-Czerkinsky CC, et al J Immunol Methods. 1983;65:109-121.
2- Karulin A.Y, Lehmann, PV. Methods Mol Biol. 2012;792:125-143.
3- Nanan R, et al  J Gen Virol. 2000;81:1313-1319.
4- Carvalho L.H, et al. J Immunol Methods. 2001;252:207-218.
5- Flynn K., et al. Immunity. 1998;8:683-691.
6- Bercovici N, et al. Clin Diag Lab Immunol. 2000;7:859-864.
7- Carter LL, Swain SL. Curr Opin Immunol. 1997;9:177-182.
8- Ezzelle J, et al. J Pharm Biomed Anal. 2008;46(1):18-29.
9- Dillenbeck T, et al. Cells. 2014;3(4):1116-1130.
10- Gazagne A, et al. J Immunol Methods. 2003;283:91-98.
11- Janetzki S, et al. Cancer Immunol. Immunother. 2008;57:303-315.
12- Britten C.M, et al. Cancer Immunol Immunother. 2008;57:289-302.
13- Cox J.H, et al. AIDS Res Hum Retroviruses. 2005;21:68-81.
14- Janetzki S, et al. Cells. 2014;3(4):1102-1115.
15- Gazagne A, et al. J Immunol Methods. 2003;283(1-2):91-98.